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       【关键词】  应用
        摘要：目的应用人巨细胞病毒-核酸扩增（HCMVPCR）反应探讨中药复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠治疗作用。方法用小鼠尾静脉染毒法建立HCMV全身获得性感染模型，并用复方黄芪颗粒给小鼠灌胃治疗，然后应用HCMVPCR反应测定其内脏HCMVDNA阳性率。结果复方黄芪颗粒42.0，21.0 g/kg组HCMVDNA阳性率明显低于模型组（P＜0.05）。结论 复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠有一定的治疗作用。
        关键词：人巨细胞病毒-核酸扩增（HCMVPCR）；  复方黄芪颗粒；  人巨细胞病毒；   人巨细胞病毒感染小鼠模型
        Evaluation of Curative Effect of Radix Astragali  Grain Small Rat ou treating Human Cytomegalovirus Infection in Mice by the HCMV- PCR  Respond
        ZHANG  Qiang,  LI  Fengqin,  ZHOU  Ling
        （Institute of  Medica,  Shandong  Academy of Medical Science, Jinan 250062, China）
        Abstract：ObjectiveTo study the curative effect of radix  astragali  grain of Chinese herbal medicine compound prescribe on right infection HCMV by HCMVPCR respond. MethodsDye the poison method to establish the HCMV whole body to acquire with vein of mice tail sexy dye the model, and counteract the radix astragali grain of compound prescribe to the mice respectively the treatment, then apply the HCMVPCR to respond to  measurese  the male rate of HCMVDNA of its internal organs. Results Radix  astragali  grain of compound prescribe 42.0 g/ kg，21.0 g/ kg  male rate of HCMVDNA of setses obviously arrive in the model set(P<0.05).ConclusionThe radix  astragali  grain of compound prescribe treatment infection HCMV mice had certainly function.
        Key words：HCMV- PCR;  Radix astragali grain;  Human cytomegalovirus;  Small rat model of HCMV infection
        人巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus,  HCMV）感染十分普遍。在妇产科，妊娠妇女孕早期原发HCMV感染可造成流产、早产、死胎、畸形，宫内生长迟缓、智力低下及听力损害等。目前，尚无对妊娠期HCMV活动性感染安全有效的治疗方法。本研究首次采用小鼠尾静脉染毒法建立HCMV全身获得性感染模型，并进行了复方黄芪颗粒对感染小鼠体内研究，应用HCMVPCR测定，证实黄芪颗粒组HCMVDNA阳性率明显低于模型组。现将本研究结果报道如下。
           1  材料
        1.1  标本收集和处理 选取60只雄性小鼠，18～22 g，共分6组，每组10只，分别为复方黄芪颗粒大、中、小剂量组，阴性对照组，模型（病毒）组和阳性对照组。均采用小鼠尾静脉注射HCMV10- 1，每只0.1 ml, 阴性对照组注射0.9%生理盐水，每只0.1 ml，于染毒第2天开始治疗。大剂量组42.0 g/kg，中剂量组21.0 g/kg，小剂量组10.5 g/kg，阴性对照组及模型（病毒）对照组均给蒸馏水，上述各组给药途径为灌胃，每天每只0.5 ml，阳性对照组（更昔洛韦），实验结束时，取主要脏器做HCMVPCR。
        1.2  HCMV PCR引物按文献［1］，由山东省医科院生物医学研究中心合成并纯化，引物序列：上游引物为5′- GATCC GACCC ATTGT CTAAG- 3′，下游引物为5′- GGCAG CTATC GTGAC TGGGA- 3′。
           2  实验方法
        PCR检测标本中HCMV- DNA片段，每次扩增均设标准阳性和阴性对照。PCR体系25 μl,其中含10×PCR缓冲液2.5 μl，2.5 mmol・L- 1dNTP 21 μl,上下游混合物（各10 mmol・L- 1）1.5 μl，TaqDNA聚合酶1 μl，标本处理后取10 μl提取物，无菌蒸馏水加至25 μl，覆以30 μl无菌石蜡油。反应按94℃ 1 min，56℃ 1 min,71℃ 1 min,40个循环，最后于72℃保温10 min，扩增物经2%琼脂电泳，溴乙淀染色，紫外灯下检测荧光条带，与阳性模板同一位置即为阳性。产物长度151 bp。
           3  结果
        上述结果表明，黄芪颗粒组HCMV- DNA阳性率明显低于模型组，与模型组比较有明显差异（P0.05），与阴性对照组相近，小剂量组与模型组相比虽无统计学意义，但其阳性率明显低于模型组。结果见表1，图1~2。
        表1  复方黄芪颗粒对感染HCMV小鼠HCMV- DNA影响组别（略）   
           4  讨论
        诊断HCMV感染主要依靠实验室检查。利用特异抗HCMV单克隆抗体的免疫组化技术，从病毒分离培养、病变组织、脱落细胞及外周血中直接检测到HCMV抗原，提示存在活动性HCMV感染，是诊断HCMV感染可靠的依据。因受灵敏度限制，检测HCMV抗原的免疫组化技术尚难于检出微量存在的病毒抗原，不能满足临床诊断要求，提高其灵敏度亟待解决［3］。原位免疫PCR技术［2］，可用于检测微量存在的抗原，极大地提高了免疫组化检测的敏感性，我们利用其基本原理,建立了检测HCMV抗原的原位免疫PCR方法,用于诊断活动性HCMV感染。研究结果表明，本法检测HCMV感染的小鼠内脏组织细胞，可在感染后8h清晰地检出阳性信号，与常规免疫组化相比阳性信号强，阳性细胞数多，显示高敏感度。HCMV感染细胞后可在细胞核内表达即刻早期、早期和晚期蛋白，即刻早期、早期蛋白通常在病毒复制前即可产生，其存在提示病毒呈活动状态［4］。本法采用pBV220质粒DNA片段作为指示元件DNA，它是与人基因组无关的DNA片段，与HCMV- DNA序列也无同源性。在检测中平行设置的阴性对照(正常小鼠内脏组织细胞、不加抗HCMV单抗),无阳性信号出现。同时我们用本法检测了收集到的5例因感染HCMV小鼠内脏组织标本，也呈阳性染色。且黄芪颗粒组HCMV- DNA阳性率明显低于模型组，与模型组比较有明显差异（P0.05），与阴性对照组相近，小剂量组与模型组相比虽无统计学意义，但其阳性率明显低与于模型组，显示本法有较强特异性。本研究成功地将原位免疫PCR技术应用于HCMV感染小鼠模型诊断，显著提高了HCMV感染诊断敏感性，为中药复方黄芪颗粒治疗HCMV感染疗效评价提供重要的参考依据。
           参考文献：
       ［1］  A lain S. T ransplanation, 1997，63:1533.
［2］  张  波，董  荷，陆哲明，等.提高免疫组织化学敏感性的原位免疫聚合酶链反应技术［J］.中华病理学杂志，1995,24(3):182 .
［3］  董永绥 .继续深入进行巨细胞病毒感染的研究［J］.中华儿科杂志,1995,33(1):34.
［4］  Gaeta A, NazzariC, Angelettis,etal.Monitor ingforcy tomegalo virus infection in organ transplant recipients: analysis of pp65 antigen, DNA and latem RNA in peripheral blood leukocy les［J］.J med V irol, 1997,53(3):189.
        (山东省医学科学院药物研究所・山东省现代医用药物与技术重点实验室，山东 济南  250062)