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       【关键词】  板蓝根；,,F022部位；,,内毒素；,,分子机理
       摘要：目的探讨板蓝根F022部位抗内毒素分子机理。方法内毒素定量检测法测定F022样品液对内毒素的破坏作用；研究样品液对内毒素致鼠巨噬细胞分泌炎性因子的抑制作用、对蛋白激酶MAPKp38活性的影响、对内毒素刺激鼠组织moesin mRNA分子表达及对内毒素诱导鼠体内TNFα,IL6和NO的抑制作用。结果1%F022对内毒素破坏率达到86.5%，F022能显著抑制内毒素刺激巨噬细胞分泌TNFα，IL6水平；抑制内毒素刺激蛋白激酶MAPKp38活性；降低内毒素刺激鼠肝、肾、脾组织moesin mRNA和体内TNFα，IL6和NO等炎性因子的表达。结论F022部位不仅直接破坏内毒素结构，且阻断内毒素引起的信号传导通路，从而抑制机体炎性因子的过度释放、抑制膜结构伸展刺突蛋白和丝裂原活化蛋白激酶的表达，从分子水平阐明了板蓝根中活性部位F022抗内毒素的分子机理。
       关键词：板蓝根；  F022部位；  内毒素；  分子机理
       Studies on the Antiendotoxic Molecular Mechanism of F022 from Radix Isatidis
       LIN Aihua， LIU Yunhai， LIU Yiming
       (1.Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510120,China; 2.Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan  430030,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the anti-endotoxic molecular mechanism of F022 from Radix Isatidis. MethodsThe content of F022pretreated ET was quantitatively determined with limulus test．The inhibition of TNFα and IL6 of murine peritoneal macrophages stimulated by LPS,the molecular expression of moesin mRNA, MAPK p38, TNFα,IL6 and NO in mice tissues induced by LPS were studied on the antiendotoxic mechanism of F022. ResultsIt was found that the ET reduction rate was 86.5%, if 1%F022was added to macrophages culture before addition of 50 ng・ml 1LPS．Production of TNFα, IL6 and MAPKp38 by macrophages were inhibited in vitro．F022 remarkably decreased the molecular expression of moesin mRNA in liver，kidney，spleen induced by LPS in mice and inhibited production of TNFα, IL6 and NO in mice stimulated by LPS.ConclusionF022  from Radix Isatidis can not only destroy the structure of endotoxin, but also obstruct the signal transduction pathways of LPS. F022 may be a strong antiendotoxin fraction in drugs research and development.
       Key words：Radix Isatidis;  F022 fraction;  Endotoxin;  Molecular mechanism
   
　　内毒素(endotoxin，ET)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)成分。可刺激机体防御系统过度释放炎性因子肿瘤坏死因子(TNFα)、白细胞介素6(IL6)及一氧化氮(NO)等而引起发热、脓毒性休克、弥漫性血管内凝血(DIC)、多器官功能衰竭综合征(MODS)，以至死亡。中医对内毒素性疾病的早期表现常辨证为“实热证”，内毒素是“热毒、邪毒”的物质基础［1］。有关内毒素的研究一直是世界生物医学研究热点，而内毒素拮抗药的研究则是防治内毒素性疾病的重要策略之一。先前研究已证实板蓝根有抗大肠杆菌O111B4内毒素作用［2，3］，我们从中筛选出抗内毒素活性强的F022 部位［4，5］，为进一步探讨F022 部位抗内毒素机理，本文研究了F022 部位对内毒素致体内外分泌TNFα，IL6和NO的影响及对内毒素受体-膜结构伸展刺突蛋白(moesin)和内毒素介导的胞内信号传导过程中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activating protein kinases，MAPK)p38激酶的影响。现报道如下。
       　　1  器材
       1.1  药品与试剂F022 部位（本室制备）,冻干细菌内毒素工作标准品(E．coli O111B4，卫生部上海生物制品研究所，120EU／支)；Tris缓冲液(pH 7．2)；细菌内毒素(4 mg/支，中国药品生物制品检定所)；TNFα和IL6试剂盒(北京邦定泰克生物有限公司)；新生小牛血清(NBS，沈阳安迪生物高科技公司)；RPMI1640细胞培养液(Gibco公司)；0.9%氯化钠注射液(0.9%NS，连云港制药厂)；LPS(E．coli O2B，5 mg/支，Sigma公司)用0．9%NS配制成100 g・L1；卡介苗(BCG，50 mg/支,上海生物制品研究所)，实验前用0.9%NS配成10 mg/ml；moesin mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物公司)，32P(Dupont NEN产品)，MAPKp38多克隆抗体(Sigma公司)，MBP(髓磷脂碱性蛋白，Sigma公司)。
       1.2  1%F022 溶液配制取F022 1 g，加适当PEG4000作助溶剂，加热熔化，加水稀释到100 ml，用NaOH液调pH 6～7，灭菌消毒备用。
       1.3  动物C57BL／6小鼠(雌性，6～8周龄，华中科技大学同济医学院器官移植研究所)；昆明种小鼠(17～22 g，3周龄，雌雄各半，华中科技大学同济医学院实验动物中心)；BALB／C小鼠(14～19 g，华中科技大学同济医学院实验动物中心)。
       1.4  仪器EDS98型细菌内毒素检测仪(北京金山川科技发展有限公司)；XW型旋涡混合器(上海医科大学研究所)。1815TC型CO2培养箱(Shel-Lab公司)；MK3型酶标仪(Labsystem Dragon公司)。
       2  方法
       2.1  F022破坏内毒素定量测定
       2.1.1  内毒素液配制取内毒素工作标准品(120EU／支)加入1 ml细菌内毒素溶解水，于旋涡混合器振荡30 s，即成120 EU／ml内毒素液。
       2.1.2  标准曲线制备分别取内毒素液适量，用细菌内毒素溶解水稀释成5.0，2.5，1.0，0.5，0.25和0.1 EU／ml 系列内毒素浓度(c)，各取0．2 ml加入鲎试剂中(双管法)，旋涡混合器振荡后迅速插入内毒素定量测定仪，记录凝胶形成时间(Tg)，用logTg对lgC作图，得标准曲线lgTg=2.800 49~0.233 26lgC，r=0.990 5，内毒素在0.1～5.0 EU/ml 浓度对数与凝胶形成时间的对数呈线性关系，最低检出限为0.05 EU/ml。
       2.1.3  回收率按上述方法，取鲎试剂5支，分别精密加入浓度为4 EU/ml内毒素液0.2 ml，测定凝胶形成时间，按标准曲线计算浓度为(4.726±0.243)EU/ml，回收率为(118.15±10.52)% 。
       2.1.4  样品测定取0.5 ml F022液与0.1 ml 内毒素液混合，于水浴(37±1)℃ 温育(60±2)min，取0.1 ml溶液加入0.4 ml细菌内毒素溶解水，此为样品组，同时设立阳性对照组和阴性对照组，测定内毒素浓度。F022对内毒素的破坏率为：［1(样品组阴性对照组)/(阳性对照组阴性对照组)］×100%。
       2.2  F022对脂多糖致鼠巨噬细胞分泌TNFα和IL6的影响
       2.2.1  鼠巨噬细胞制备按文献［6］，取C57BL/6小鼠，腹腔注射BCG 2 mg/只， 4 d后拉颈处死动物，在无菌条件下注入冰冷的RPMI1640培养液5ml（含80U・ml1青霉素，100 μg・ml1链霉素，10 U・ml1肝素），轻揉腹部数次，抽取腹腔液，离心1 500 r/min，用无血清的RPMI1640洗涤细胞2次，加入含10%灭活小牛血清的RPMI1640培养液，调整细胞浓度为2×106个/ml，加入24孔培养板内，每孔1 ml，置37℃,5% CO2培养箱内培养2 h后，用无血清的RPMI1640洗去非粘附细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞。
       2.2.2  TNFα和IL6的诱生按文献［5］将含1%样品液预处理巨噬细胞1h后，再加入终浓度为50 ng・ml1的LPS，另设阴性对照组(RPMI1640液)和阳性对照组,分别培养6 h和24 h后取上清液，于20℃保存待测。
       2.2.3  TNFα和IL6的定量检测ELISA法测定各标准品和样品光密度值（OD）,以各标准品浓度对OD值作标准曲线，结果表明TNFα和IL6浓度在0.1~10 ng・ml1范围内与OD值具有良好的线性关系。由标准曲线求算出待测样品的TNFα和IL6的含量，作统计学t检验。TNFα抑制率=［1(样品组空白对照组)/(模型组空白对照组)］×100%。IL6抑制率的计算方法同上。
       2.3  F022对脂多糖诱导P38丝裂原活化蛋白激酶的影响
       2.3.1  细胞液制备与药物处理按2.2.1的方法制备细胞液，转移至24孔培养板上，于无菌培养箱中培养。将含1% F022的培养液1ml预处理巨噬细胞1 h后，再加入终浓度为50 ng・ml1的LPS，另设阴性对照组和阳性对照组,分别培养6 h后，检测细胞内MAPKp38活性。
       2.3.2  蛋白激酶MAPKp38活性测定按文献［7］，每孔细胞经冰冷磷酸缓冲液洗涤后加入1 ml细胞溶解液，细胞经冻融处理，离心(12 000r／min，4℃，30 min)，取上清0.5 ml与5μg特异性MAPKp38抗体于4℃共同孵育4h，收集免疫复合物与预先吸附有抗鼠的琼脂培养基孵育30 min，沉淀下的蛋白加入溶解液在25℃孵育25 min，取100μl点于P8/phosphocellulose(磷酸纤维素滤纸)上，在液体闪烁仪上测定髓磷酸脂碱性蛋白32P的掺入量，结果以每分每毫克蛋白掺入32P的pmol数(pmol/mg・min表示)。
       2.4  F022对脂多糖刺激鼠组织moesin mRNA表达影响
       2.4.1  标本制备将18只小鼠随机分为样品组（A）、阳性对照组（B）、阴性对照组（C），每组6只。实验前一周腹腔内注射BCG 2 mg/只,实验前12 h禁食不禁水，实验当天给予A、C组1%样品液0.4 ml/只，B组给予同等量0.9% N S灌胃，30 min后，A、B组小鼠尾静脉注射LPS 800 ng/20g，9 h后乙醚麻醉，取肝、脾、肾组织，立即用4%多聚甲醛固定。
       2.4.2  moesin mRNA原位杂交按常规操作将各组织切片，脱蜡入水，3%双氧水室温处理10 min以灭活内源性过氧化物酶，暴露mRNA核酸片段；切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37℃消化25 min。充分洗涤后，按每张切片加20 μl含寡核苷酸探针的原位杂交液。于湿盒中，37~40℃杂交过夜。每张切片取2 μl杂交探针稳定液A和18杂交探针稳定液B混匀，加在切片上，再反应6 h，2×SSC洗涤5 min 3次。滴加封闭液，37℃ 20 min。滴加兔抗地高辛，37℃ 60 min。充分洗涤后，滴加生物素化羊抗兔IgG ，37℃ 20 min。充分洗涤后，滴加SABC，37℃20 min。DAB显色20~30 min，用苏木素复染，充分水洗。酒精脱水，二甲苯透明，封片。镜下观察胞浆着色呈棕黄色者为阳性。
       2.5   F022对脂多糖诱导鼠体内TNFα，IL6和NO的抑制作用
       2.5.1  血清样品制备按2.4.1的方法分组给药，9 h后，乙醚麻醉，眼眶内取血，静置后取血清，-20℃ 贮存备用。
       2.5.2  TNFα和IL6检测按2.2的方法检测并计算抑制率。
       2.5.3  NO检测采用Griess试剂法。取待测血清50 μl，加入等体积的Griess试剂，室温放置反应10 min，应用酶联免疫检测仪在550 nm波长下测定样品的吸光度。
       　　3  结果
       3.1  F022对内毒素的破坏作用1% F022液对内毒素的破坏率为86.5%。
       3.2  F022对LPS处理巨噬细胞分泌TNFα和IL6的影响结果表明，F022能抑制巨噬细胞分泌TNFα和IL6；抑制率分别为69.70%，83.60%。结果见表1。
表1   F022对LPS致鼠腹腔巨噬细胞分泌TNFα和IL6的影响（略）
       3.3   F022对LPS诱导鼠蛋白激酶MAPKp38的影响药物组的MAPKp38活性与阴性对照组比较差异无显著性，而单纯LPS组，MAPKp38活性升高明显，差异有极显著性意义(P<0.01)。结果见表2。表2   F022对LPS诱导鼠蛋白激酶MAPKp38的影响（略）
       3.4   F022对脂多糖刺激鼠组织moesin mRNA表达的影响图像分析采用北航医学图像处理系统给予原位杂交显色强度计分。计量资料用t检验，计数资料用χ2检验。结果见表3。由表3可见，SA可抑制LPS刺激小鼠组织moesin mRNA表达，且在不同组织有明显差异，肝和肾内表达强于脾脏。表3   F022对脂多糖刺激鼠组织moesin mRNA表达的影响（略）
       3.5  F022对LPS诱导鼠体内TNFα，IL6和NO的抑制作用小鼠经不同浓度F022部位处理后再给予同等剂量LPS，其血清中TNFα、IL6和NO浓度及抑制百分率见表4。由表可见，板蓝根有效部位对LPS刺激小鼠体内释放TNFα，IL6和NO有抑制作用。表4   F022对LPS诱导鼠体内TNFα，IL6和NO的抑制作用（略）
       　　4  讨论
       细菌内毒素与靶细胞相互作用可表现出广泛的生物学活性，从分子水平上看，该作用主要通过内毒素和其受体之间特异性结合来介导，LPS与受体结合后，通过G蛋白偶联，激活蛋白激酶，完成信号跨膜转导，激活单核巨噬细胞，促进 TNFα，IL6，NO等炎性因子的释放。我们前期研究证明［3~5］，板蓝根F022能直接中和LPS，破坏其超微结构。本文对F022部位的内毒素破坏作用了定量研究，发现1% F022液对内毒素破坏达到86.5%，在内毒素致病的信号传导过程中，内毒素受体起了关键性作用。目前，已发现的内毒素受体主要有CD14、膜结构伸展刺突蛋白(moesin)、钟声类蛋白、低密度脂蛋白等，其中与致病关系密切的是CD14，moesin和钟声类蛋白。国外有研究表明，应用moesin单克隆抗体可阻止LPS的生物效应达90%以上，而CD14的抗体却只能拮抗LPS生物效应50％左右［8］。因此，本课题选择moesin作为内毒素受体的检测对象，结果显示，按800 ng・20 g1LPS刺激后小鼠9 h后的肝、肾、脾内moesin mRNA表达较明显，其计分值与对照组比较，差异有极显著性。而预先给予1%F022液的小鼠，其计分均较LPS组低，可见板蓝根可影响LPS刺激的moesin mRNA的分子表达程度。
       MAPKp38 激活是胞内信号传导很重要的环节，通过激活MAPKp38，启动效应分子如肿瘤坏死因子TNFα，IL6，NO等的基因表达和产生，由此导致一系列的病理生理反应［9］。从板蓝根对抑制LPS诱导的蛋白激酶MAPKp38活性实验结果可见，LPS对F022液的预处理的巨噬细胞MAPKp38活性未见明显增强，体内外TNFα、IL6、NO水平无明显上升，与单独加入LPS后这些指标显著增高相比，差异有极显著性意义(P<0．01)。可见板蓝根可特异性抑制由LPS介导的MAPKp38活性。
       　　参考文献：
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       1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州  510120； 
       2.华中科技大学同济医学院附属同济医院，湖北 武汉   430030
       基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.39870872）
       作者简介：林爱华(1976），男（汉族），江苏海安人，现任广州中医药大学第二附属医院室主管药师，硕士学位，主要从事中药制剂及其生物有效性研究工作.
       通讯作者简介：刘云海(1942），男（汉族），江苏如东人，现任华中科技大学同济医学院附属同济医院主任药师，学士学位，主要从事医院药学研究工作.