厚朴酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用与γ-氨基丁酸的关系
作者：刘可云，黄贤珍
《时珍国医国药》 2006年 第6期
多个检索词，请用空格间隔。
【关键词】 厚朴酚；,,脑缺血再灌注；,,γ-氨基丁酸；,,谷氨酸
摘要：目的研究厚朴酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用与γ 氨基丁酸（GABA）的关系。方法采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，用高效液相 荧光法测定大鼠脑组织谷氨酸（GLU）和GABA的含量。结果厚朴酚可以明显降低脑缺血再灌注后GLU含量，增加GABA的含量。结论 厚朴酚对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用，该作用与其提高抑制性氨基酸GABA的含量，产生抑制性保护作用有关。
关键词：厚朴酚； 脑缺血再灌注； γ-氨基丁酸； 谷氨酸
Neuroprotective Effect of Magnolol against Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury and the Relation to GABA in Rats
LIU Ke yun, HUANG Xian zhen
(1．Department of Pharmacology, School of Medicine, Hubei College for Nationalities, Enshi 445000, China; 2. The Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi 563003, China)
Abstract：Objective To study the protective effect of magnolol against focal cerebral ischemia-reperfusion injury and the relation to gamma- aminobutyric acid （GABA）in rats. MethodsThe middle cerebral artery occlusion(MCAO) model in rats was established to investigate the role of magnolol. The levels of glutamate (GLU) and GABA in cerebral tissue were measured by high performance liquid chromatography-fluorometer (HPCL FR) method. ResultsThe levels of GLU markedly decreased while the levels of GABA obviously increased by magnolol in MCAO rats.ConclusionMagnolol could prevent MCAO rats from ischemia-reperfusion injury, the pretective effect is related to magnolol keeping dynamic balance of excition-inhibition ,and persisting inhibition depended effect.
Key words：Magnolol; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Gama-aminobutyric acid; Glutamate
缺血性脑血管疾病是临床常见、多发且预后较差的疾病。脑缺血再灌注损伤的机理非常复杂，目前研究提出的兴奋 抑制失衡假说认为：脑缺血时脑内γ 氨基丁酸(γ aminobutyric acid,GABA)的含量进行性下降，内源性抑制作用降低，兴奋性毒性增加，引起兴奋 抑制失衡，是脑缺血损伤的重要因素之一［1］。另有报道，GABA及其拟似剂可以治疗脑缺血后因兴奋性氨基酸大量释放引起大脑的神经损伤［2］。因此抑制性神经递质可能成为临床防治脑缺血损伤新的靶点。厚朴酚(magnolol)是中药厚朴的主要活性成分，有报道［3］对脑缺血有保护作用。另有研究发现厚朴酚在体外对GABAA受体有激动作用［4］。但有关厚朴酚对脑缺血再灌注损伤保护作用与GABA的关系的研究目前国内外还没有报道。本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型，观察厚朴酚对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用与GABA的关系。
1 材料与方法
1.1 主要药品和试剂厚朴酚由重庆医科大学药学院提供，纯度>90％。甲醇(色谱醇)购自上海凌峰化学试剂厂。谷氨酸 (GLU)和GABA标准品购自上海试剂三厂。
1.2 主要仪器美国惠普公司HP 1050型高效液相色谱仪。德国BeckmanJ2 21型高速离心机。
1.3 实验动物分组及给药方法40只健康清洁级Wistar大鼠，体重为（300±20）g，雌雄不限，购自重庆医科大学实验动物中心。随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组、小剂量厚朴酚预处理组、大剂量厚朴酚预处理组，每组10只。其中厚朴酚预处理组于实验前3 d开始灌胃给药，给药剂量分别为25 mg/kg和75 mg/kg。
1.4 大脑中动脉闭塞(MCAO)模型的制作
参照Longa等［5］的线栓法，用10％水合氯醛(4 ml ・kg 1，ip)麻醉大鼠，将麻醉后的大鼠仰卧位固定，消毒皮肤，铺无菌孔巾，颈正中切口，分离左侧颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉，结扎颈总动脉、颈外动脉，于颈总动脉分叉切口处向颈内动脉插入栓线约(18.5±0.5) mm，感觉有阻力即达大脑中脉起始部，完全阻断其血流，结扎颈内动脉。2 h后拔出栓线，再灌注24 h，即造成缺血再灌注模型。所用栓线为直径0.2 mm尼龙渔线，头段烧圆，顶端直径约0.25~0.28 mm。术中室温在（27±0.5）℃。术后缝合伤口，动物回笼。术中保持肛温恒定。动物清醒后出现以左前肢偏瘫为主的神经功能缺失表现为模型成功的标志。凡呼吸困难、术中出血量较大、术后30 min仍未苏醒者均弃之不用。假手术组除了不插栓线外，其余步骤同手术组。
1.5 标本处理全部大鼠剪断头部，迅速取脑，在冰盘上分离缺血侧脑组织，电子天平准确称重，即刻冻存在-20℃冰箱。取脑组织于匀浆器内用甲醇反复充分溶浆3次，转移合并提取液至离心管内，置超声波上处理30 min，10 000 r・min 1，10℃以下冷冻离心30 min，将上清液转入液闪瓶内，80℃水浴使甲醇蒸发干,瓶内准确加入1.35 ml 0.1mol・L 1的HC1，再超声处理30 min，使氨基酸充分溶出。将溶出物再次冷冻离心30 min，取上清液用于氨基酸分析。
1.6 氨基酸分析
色谱条件：HP Hypersil ODS (4 mm×125 mm)5μm ，流动相A：8.0 mmol・L 1磷酸缓冲液(pH 7.2)，流动相B：8.0 mmol・L 1 磷酸缓冲液(pH7.2)+甲醇+乙腈(50+35+15)，流量1.0 ml・min 1，柱前自动衍生程序：设置自动进样程序为依次吸取1μl OPA试剂，5μl 0.1 mol・L 1，pH 10.4硼酸缓冲液和1 μl样品，梯度洗脱程序：0 min，0％B；25 min，100％ B；35 min，100％ B；35 min，100％ A；45min，100％A。检测程序：荧光检测器波长Ex=340 nm，Em =450 nm。
1.7 统计学处理采用SAS统计软件，所有实验数据以 ±s表示，不同组间比较采用方差分析，两样本间比较采用Q检验。检验水准α＝0.05。
2 结果
脑缺血2 h再灌注24 h后，与假手术组比较脑组织GLU显著升高(P<0.01)，GABA显著降低（P<0.01）。厚朴酚组与模型组比较GABA均显著性升高(P<0.01)，大剂量厚朴酚组与模型组比较GLU显著性降低(P<0.01)，但小剂量厚朴酚组与模型组比较降低没有显著性(P>0.05)。结果见表1。表1 厚朴酚对脑缺血再灌注后脑组织GLU 和GABA含量的影响 (略)
3 讨论
脑缺血后兴奋性氨基酸(EAA)过量释放，产生兴奋性毒性。GLU是最主要的中枢兴奋性氨基酸递质，具有很强的神经毒性。GABA是脑内主要的抑制性氨基酸递质，由GLU脱羧而成，其主要生理功能是与受体结合后使神经元产生突触前或突触后抑制。许多研究认为，再灌注后兴奋性氨基酸大量释放，作用于突触后神经元．产生兴奋性神经毒作用，导致突触后神经元损害［6］。有研究发现在缺血早期EAA大量释放的同时，脑内GABA的释放也相应增加，在后期脑内GABA含量降低。缺血早期GABA大量释放，可能是由于在正常情况下神经递质水平受一个耗能的、内流――外流循环转运系统所控制，缺血时由于能量衰竭转运系统受抑制，因此去极化导致的递质外流和重摄取抑制是GABA升高的主要原因［7］。近年来大量研究表明GABA对脑缺血有保护作用，在脑缺血再灌注后GABA降低可能加重脑损伤［1~8］。另有报道，GABA及其拟似剂可以治疗脑缺血后因兴奋性氨基酸大量释放引起大的神经损伤［2］。采用生物鉴定法，在可逆性MCAO缺血模型上的研究发现，缺血5 min后腹腔注射GABA B激动剂baclofen 20 mg／kg具有神经保护作用［9］。
厚朴酚是传统中药厚朴的主要成分，现代药理学研究证明具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、拮抗钙调素、神经保护作用等多种药理作用。现已证明，以鼠胚脊髓运动神经元原代培养的实验模型，实验组分别加入单味中药提取物，用MTT法观察其对细胞活力的影响。发现厚朴对脊髓运动神经元有保护作用。对周围神经损伤的修复可能有促进作用［10］。也有研究表明厚朴酚能通过抗氧化作用降低脑缺血/再灌注神经元损伤［3］。近来研究发现厚朴酚与和厚朴酚对GABAA受体具有选择性激动作用［4］。
本实验研究显示，脑缺血2 h再灌注24 h后脑组织GLU大量释放，而GABA明显下降。厚朴酚预处理可以降低GLU释放，增加GABA水平，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
厚朴酚可以改善脑缺血再灌注损伤引起的GLU升高、GABA降低而产生保护作用，可能与下列中枢作用有关：①作为GABA受体的激动剂与受体结合而发挥GABA的作用；②对谷氨酸脱羧酶有促进作用，增加GABA的合成和释放，抑制GABA转氨酶，减少GABA的代谢最终增加脑内GABA水平，而对脑缺血产生抑制性保护作用。但是这些假说还有待进一步研究证实。
参考文献：
［1］Schwartz-Bloom RD,Sah R.gamma- aminobutyric acid(A)-neuro-transmission and cerebral ischemia［J］. Neurochem, 2001，77(2):353.
［2］Nelon RM,Hainsworth AH,Lambert DG, et al. Neuroprotective efficacy of AR-A008055,a clomethiazole analogue,in a global model of acute ischemia stroke and its effert on ischemia-induced glutamate and GABA efflux in vitro［J］.Neuropharmacology,2001，41（2）：159.
［3］Zhang Guang-Qin，Chen Shi-Zhong，Hao xue-Mei,et al.The protective of magnolol on cerebral ischemia［J］. Chinese pharmacological bulletin， 2003， 19(9): 1020.
［4］Ai,-J; Wang,-X; Nielsen,-M. Honokiol and magnolol selectively interact with GABAA receptor subtypes in vitro［J］. Pharmacology，2001，63(1): 34.
［5］Longa EZ，Philip MD．Reversible middle cerebralartery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1)：84.
［6］张 萍．谷氨酸及其受体变化与神经细胞损害［J］.国外医学・神经病学神经外科分册，1995，22(4)：182．
［7］Shuaib A, Ijaz MS, Miyashita H, et al. GABA and glutamate levels in substantia nigral reticulation following repeatitive cerebral ischemia in gerbils［J］.Exp Neurol,1997，147(2):311.
［8］Green AR, Hainsworth AH, Jackson DN, et al.GABA protentiation：A logical approach for the treatment of acute ischemia stroke［J］. Neuropharmacology，2000，39(9):1483.
［9］Friedman CJ，Lyden PD．Nanez S， et a1．High dose baclofen is neuroprotective but also causes intracerebral hemorrhage：a quantal bioassay study using the intraluminal suture occulsion method［J］.Exp Neurol，1997，147：346．
［10］张艳军. 增强原代培养鼠胚脊髓运动神经元活力的中药筛选［J］.天津中医学院学报，2004，23(2):75.
1.湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000；
2.遵义医学院附属医院 ，贵州 遵义 563003
作者简介：刘可云(1975 )，男(土家族)，湖北恩施人，现任湖北民族学院医学院讲师，硕士学位，主要从事神经药理学、中药药理及新药开发工作.