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       【关键词】  高良姜素；,,L
       摘要：目的制备水溶性高良姜素衍生物，提高高良姜素的生物利用度。方法采用过量的L精氨酸与高良姜素在乙醇中回流反应，反应混合物经柱层析分离纯化，得3个水溶性化合物B，C，D。结果经TLC，UV，IR谱初步分析，确定B，C，D分别为：高良姜素一精氨酸酯、高良姜素二精氨酸酯、高良姜素三精氨酸酯。高良姜素，B，C，D 抑制红白血病K562细胞生长的IC50（μg/ml）值分别为：26.2，40.4，47.9，60.5。结论 此高良姜素水溶性衍生物的制备反应为一酯化过程；但高良姜素结构中羟基封闭不利于其生物活性的保持。
       关键词：高良姜素；  L精氨酸；  水溶性衍生物；  K562细胞
       Study on Preparation of the Water Soluble Galangin-arginine Ester
       FU Weiyu,  ZHANG Jianhe,  LUO Hui,  SHE Ji*, LIANG Nianci
       （Department of Chemistry, Guangdong Medical College, Zhanjiang, 524023, China）
       Abstract：ObjectiveTo prepare the water solubte galanginarginine derivative and improve the bioavailability of galangin (Ga). MethodsOverdosly Larginine and Ga were refluxed in alcohol. Reaction compounds were isolated on silica gel column chromatography and their structures were identified by spectral and chemical analysis. ResultsThree water solube compounds were isolated and identified as galanginmonoargininate(B), galangindiargininate (C) and galangin-triargininate (D). Ga, B, C and D inhibited the growth of erythroleukoemia K562 cells, and the inhibited IC50(μg/ml) values were 26.2, 40.4, 47.9 and 60.5. ConclusionThe above preparation of the water soluble Galanginarginine derivative were esterification process,but the blocking of Hydroxyl in Ga structure was disadvantageous to keep its bioavailability.
       Key words： Galangin;  Larginine;  Watersoluble derivative;  K562 Cell
   
　　高良姜Alpinia officanorum是南方广泛种植的一类药用植物［1］。高良姜素(galangin）属黄酮类化合物，是高良姜的主要成分之一，同时也存在于多种植物体中。高良姜素明显的抗癌、抗氧化、抗病毒、抗致畸等作用日益得到关注［2］，但与大多数的黄酮类苷元相似，高良姜素几乎不溶于水，限制了给药途径，影响其在体内的吸收和代谢［3］。为了拓宽高良姜素的临床用途，提高其生物利用度，本研究组尝试通过高良姜素与精氨酸结合制备水溶性的药物前体［4，5］，就制备工艺、产物的结构以及衍生物对癌细胞的抑制作用进行了初步的探讨。
       　　1  仪器与材料
       1.1  仪器Lambds
       2s型紫外/可见光谱仪（PE公司）；175C/UMA500型显微红外光谱仪（BioRAD公司）；852型恒温磁力搅拌器（深圳天南海北有限公司）；CO2孵箱（Precision）；IS6000型液闪记数仪（Beckman）。
       1.2  材料  
       高良姜素按文献［1］提取纯化；L-精氨酸（上海丽珠东风生物技术有限公司）；薄层层析用硅胶GF254（青岛海洋化工厂）；柱层析用200~300目硅胶（青岛海洋化工厂）；其它试剂均为分析纯。
       　2  方法与结果
       2.1  高良姜素精氨酸酯的制备高良姜素121.1 mg（0.448 mmol），微温下完全溶于40 ml无水乙醇中，然后加入L精氨酸470 mg（2.7 mmol），搅拌下，滴加pH=10~11的Na2CO3溶液，将反应系统调至pH=8左右，加热搅拌回流48 h，TLC监测反应进程。反应结束后，减压除去溶剂至干，再加入经干燥处理的无水乙醇溶解，减压过滤，滤液浓缩至小体积，经200~300目硅胶柱层析分离。
       2.1.1  经石油醚∶醋酸乙酯=5∶1→1∶1梯度洗脱，得难溶于水的化合物A：34.9 mg；Rf =0.86（展开剂：石油醚∶醋酸乙酯=2∶1），高良姜素的Rf =0.86；显色：紫红色（FeCl3）；黄绿荧光（AlCl3，紫外灯）；橙红色（2.4二硝基苯肼）。
2.1.2  经醋酸乙酯∶甲醇=5∶1→1∶1梯度洗脱，得可溶于水的化合物B：52.7 mg；Rf =0.67（展开剂：醋酸乙酯∶甲醇=8.5∶1）；显色：紫红色（FeCl3）；黄绿荧光（AlCl3，紫外灯）；橙红色（2.4二硝基苯肼）。
       2.1.3  经醋酸乙酯∶甲醇=2∶1洗脱，得易溶于水的化合物C：111.7 mg；Rf =0.22（展开剂：醋酸乙酯/甲醇=2∶1）；显色：紫红色（FeCl3）；黄绿荧光（AlCl3，紫外灯）；橙红色（2.4二硝基苯肼）。
       2.1.4  经醋酸乙酯∶甲醇=1∶1→1∶5梯度洗脱，得易溶于水的化合物D：55.0 mg；Rf =0.22（展开剂：为醋酸乙酯/甲醇=1∶5）；显色：无色（FeCl3）；浅黄荧光（AlCl3，紫外灯）；橙红色（2.4二硝基苯肼）。
       2.2  高良姜素、A、B、C、D的紫外吸收谱（见图1）及λMeOHmax（见表1）和红外吸收谱（见图2）得到测定。
       2.3  对红白血病K562细胞生长的抑制作用采用MTT法观察高良姜素、B、C、D分别在48 h对K562细胞生长的抑制作用。各样品用DMSO配成原液，超声震荡。各药物临用前用对应溶剂稀释至所需浓度，煮沸30min灭菌。处理细胞时，DMSO的终浓度小于或等于0.1%，实验表明该浓度对细胞无影响。
       取对数生长期的K562细胞1.0×105/ml，加入24孔板。每孔1 ml，用药组分别加入相当于各样品：5，10，20，40，80μg/ml的各溶液1 μl，对照组只加入1μl DMSO，每组均设3个平行孔，设好空白对照孔。加药的细胞于37℃、5%CO2的饱和湿度孵箱中培养48 h后，用台盼蓝拒染法并在倒置显微镜下进行活细胞计数。计算各药物对细胞的抑制率，并按改良Karber该上公式计算得高良姜素、B、C、D的IC50（μg/ml）值分别为：26.2，40.4，47.9，60.5。
       　3  讨论
       3.1  由TLC、UV、IR的数据可以确定，A与高良姜素为同一化合物。在IR谱上，B、C、D在1 126 cm1、1 060 cm1明显的双峰，表明酯键的存在；而3 300 cm1的N+-H强吸收宽峰、2 934 cm1的N+H2特征峰和1 650 cm1、1 576 cm1的gN+H特征峰存在，则应表明B、C、D结构中NH2处于游离状态。高良姜素、B、C、D的TLC的Rf值说明，高良姜素、B、C、D的极性是依次增强的，显示高良姜素与精氨酸结合的信息［6］。结合B、C、D的TLC斑点的显色情况和各自的紫外吸收曲线，B、C、D的仍具备黄酮类化合物的典型结构。但与高良姜素的λMeOHmax：265  nm、363 nm比较，B、C的λMeOHmax值明显向短波收缩，D的最大吸收峰几不可见，这种现象与高良姜素上的羟基部分或全部被酰化有关［7］。我们认为，通过滴加Na2CO3溶液调节反应系统至弱碱性，不仅提高了高良姜素上羟基的活性，同时这碱性环境可能也有利于精氨酸与高良姜素的酯化，而不是生成精氨酸铵盐类的复合物。由TLC、UV、IR的数据可以初步确定B、C、D分别为：高良姜素一精氨酸酯、高良姜素二精氨酸酯和高良姜素三精氨酸酯。进一步的结构分析有待进行。
       3.2  在制备工艺的选择中，当高良姜素与精氨酸的投料摩尔比为1∶1时，产物较单纯，但产率低，实用价值不大。通过高良姜素与过量的精氨酸反应，产物比较复杂，但通过分离纯化后，得到了3种水溶性的高良姜素衍生物，以此可以研究不同的羟基被封闭后的性质，并且产率得到较好的提高。增加Na2CO3溶液的滴加量，提高反应系统的pH值，可以提高反应速度，但也可能导致黄酮环的破裂。
       3.3  对红白血病K562细胞生长的抑制作用显示，3种水溶性的高良姜素衍生物B、C、D仍具有抑制K562细胞生长的作用，但与高良姜素相比，IC50值呈倍数增加。表明当高良姜素上羟基逐渐被封闭后，其抑制K562细胞生长的活性也随之降低，这说明高良姜素上各羟基的存在是其保持生物活性的必需。因此，为改善高良姜素理化性质的任何结构上的改造，应尽量避免封闭其结构中游离的羟基。
       　　参考文献：
       ［1］罗  辉，蔡  春，张建和，等. 高良姜化学成分研究［J］.中药材，1998，21(7):349.
       ［2］何  瑞，王  涛，李彩君，等. 天然化学成分高良姜素研究进展［J］.时珍国药研究，1999，10(10):788.
       ［3］赵维中，戴利明，方  明，等. 槲皮素在兔体内的药代动力学［J］.中国药理学报，1992，8(6):452.
       ［4］郑惠珍，唐朝枢.  L精氨酸的跨膜转运及临床意义［C］.国外医学生理、病理科学与临床分册，1999，19(6):475.
       ［5］符伟玉，佘  戟，莫丽儿，等. 槲皮素精氨酸复合物的制备研究［J］.中草药，2002，33（8）:695.
       ［6］佘  戟，陈  杰，莫丽儿，等. 胶束纸色谱分离和鉴定黄酮类化合物［J］.广东医学院学报，1999，17(2):102.
       ［7］K. R,马卡姆. 黄酮类化合物结构鉴定技术，第1版［M］.北京：科学出版社，1990:44.
       (广东医学院，广东 湛江  524023)
       基金项目：广东省湛江市科委资助项目（No.42）
       作者简介：符伟玉(1976)，女(汉族)，广西桂林人，现任广东省广东医学院化学教研室讲师，学士学位，主要从事天然药物的药物化学及生化药理学研究工作.
       通讯作者简介：佘  戟(1964)，男(汉族)，广东湛江人，现任广东省广东医学院化学教研室副教授，学士学位，主要从事药物化学研究工作.