几种金银花的高效液相色谱法鉴别与系统聚类分析
作者:赵惠茹, 王锐平, 路平, 魏彩霞, 王燕
《时珍国医国药》 2007年 第2期
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【关键词】 金银花;高效液相色谱;系统聚类分析
摘要:目的鉴别17种金银花的质量。方法采用高效液相色谱法对样品进行分析,获得反映样品整体化学特征的数据,利用聚类分析进行分类。结果在选定的色谱条件下,建立了稳定可控的药材高效液相色谱图,系统聚类法可将样品有效地分类。结论该方法鉴别金银花是可行的,能为其质量评价提供有用的信息。
关键词:金银花;高效液相色谱;系统聚类分析
Identification and Cluster Analysis of Several Species of Flos Lonicerae
ZHAO Hui ru, WANG Rui ping, LU Ping, WEI Cai xia, WANG Yan
(Department of Pharmacy,Xi"an Medical College, Xi"an 710068,China; The Affilated Hospital of Yan"an University,Yan"an 716000, China )
Abstract:ObjectiveTo identify 17 species of Flos Lonicerae. MethodsThe chemical variables as a whole were obtained by HPLC; the classification was carried out by using the hierarchical clustering analysis. ResultsUsing above optimum chromatography conditions,the HPLC chromatographies of Flos Lonicerae were established; the 17 samples were categorized efficiently. ConclusionThis method is useful in the species identification of Flos Lonicerae, and it can elementary distinguish the quality of them.
Key words:Flos Lonicerae;HPLC;Cluster analysis
金银花始载于《名医别录》,历代本草均有记载。2005年版《中国药典》收载的种类为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花[1]。其作为常用中药,具有清热解毒、疏散风热的功效。在临床上广泛用于急性热病及外科感染性疾病。该药材植物来源复杂,在全国几乎都有分布。据文献[2,3]报道,目前市售金银花商品十分混乱,有47余种植物的花蕾在各地均被当作金银花入药,如不加以区别,便会影响临床疗效。针对这一客观存在的问题,本文对不同来源的17种金银花样品的化学成分进行了HPLC分析,由此获得金银花的化学信息,应用系统聚类分析的方法进行分类,为制定综合评价金银花质量的新方法进行了探索。近年来,系统聚类方法[4,5]越来越多地应用于中药材鉴别与分析领域,这是利用数学手段对一群事物按其“属性”进行分类的方法。它作为一种特定的方法,从数据分析的角度给出了一个更准确、细致的分类工具。本文即用此法对金银花进行了研究,结果准确可靠,为中药金银花的正、伪品鉴别分析提供了一种新的方法。
1仪器与材料
1.1仪器Agilent 1100高效液相色谱仪(脱气机、四元泵、紫外检测器、柱温箱、HP Chemstations 工作站);KQ-50型超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂)。
1.2试药绿原酸对照品和金银花对照药材(中国药品生物制品检定所),乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,三蒸水(自制)。金银花样品分别购自各地药材公司,经本院天然药物教研室鉴定,其来源及编号见表1。
2方法
2.1色谱条件YGW-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm); 流动相:A液 乙腈,B液 0.5%磷酸水溶液,梯度洗脱(0~12 min:乙腈∶5%~15%,12~20 min:乙腈∶15%~25%,20~30 min:乙腈∶25%~30%,30~40 min:乙腈∶30%~5%);流速:1.0 ml・min-1;检测波长:327 nm;进样量:20 μl ;柱温:25℃。
表1样本来源与编号(略)
2.2绿原酸对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品1.0 mg,用乙腈 0.5%磷酸水溶液(5∶95)定容至10 ml,配成0.100 0 mg・ml-1的原液备用。
2.3金银花药材对照品的制备精密称取金银花药材对照品100 mg ,用乙腈 0.5%磷酸水溶液(5∶95)定容至10 ml,超声提取30 min后过滤,滤液作为药材对照品溶液备用。
2.4供试品溶液的制备将以上各金银花样品干燥后粉碎,过60目筛,精密称取各样品粉末100 mg ,用乙腈 0.5%磷酸水溶液(5∶95)定容至10 ml,超声提取30 min后过滤,滤液作为样品溶液备用。
2.5方法学考察
2.5.1稳定性实验取同一份供试品溶液(金银花药材2),分别在0,2,4,8,16,24 h检测,其相对保留时间RSD均小于3%,主要峰面积RSD小于5%,说明溶液至少在24 h内稳定。
2.5.2精密度实验取同一份供试品溶液(金银花药材2),连续进样5次,考察色谱峰的相对保留时间和主要峰面积比值的一致性。结果各色谱峰的相对保留时间和主要峰面积比值的RSD均小于3%,说明精密度良好。
2.5.3重复性实验取金银花药材2供试品5份,同法检测,考察色谱峰相对保留时间和主要峰面积比值的一致性。结果各色谱峰的相对保留时间和主要峰面积比值的RSD均小于2%,说明分析方法重复性符合要求。
2.6测定法取金银花药材对照品溶液和供试品溶液按照2.1项下色谱条件进样分析,得到金银花对照药材的高效液相色谱图(见图1)和17批样品的高效液相色谱图。同时用绿原酸对照品溶液同体积进样分析,确定绿原酸的出峰时间。以金银花对照药材中各色谱峰的总面积为分母,样品中各个色谱峰面积为分子,计算该色谱峰的相对峰面积值。结果见表2。
5-绿原酸
图1金银花药材对照品的高效液相色谱图(略)
表2样本中各峰的相对峰面积(略)
3结果
应用SPSS10.0统计软件对获得的HPLC数量化特征进行系统聚类分析,结果见图2。
图217种金银花的系统聚类分析(略)
4讨论
4.1按本实验拟定的方法,测定了17批金银花样品的高效液相色谱图,选择其中峰面积最大的8个峰排列成表,并结合各色谱峰在17批样品中出现的频率,共标出12个共有峰,总共有峰峰面积含量在85.92%~91.46%之间,各批样品间主要共有峰的相对保留时间亦较稳定,峰值比例较典型。以12个共有峰作为聚类分析的指标,精密度、稳定性、重复性实验良好,因此,可初步拟定为金银花乙腈提取物成分的指标成分群。
4.2本实验比较了等度洗脱和梯度洗脱对金银花高效液相色谱图的影响,结果发现等度洗脱时,改变流动相的组成或比例只能得到较少的色谱峰,而改用梯度洗脱,则可得到金银花药材所含组分的大量信息,样品中不同极性的组分均获得了相对稳定的峰形和峰面积,且基线较平稳,保留时间适宜,分离效果较好。
4.3由聚类分析结果可以看出,样品1~10,16,17号聚为一类,它们分别来源于忍冬和山银花,样品12,14,15号与样品11,13号首先分别各自聚为一类,然后再共聚为一大类,它们分别为金银花的各地常见代用品。可见,在本文的色谱实验和聚类分析参数条件下,金银花正品与各地代用品的分类鉴别效果比较明显。但是8种正品金银花之间的鉴别效果并不甚理想,且缺乏量化指标,其原因是否与产地和生长环境有关,尚待实验研究。
4.4目前,金银花的鉴别和分类很大程度上还依赖于经验和表观分析,缺乏从分析数据中获取依据的方法。本实验基于金银花高效液相色谱图整体面貌的共性特征,选取了包括绿原酸在内的12个特征峰,获得了相对峰面积值,用系统聚类分析的方法对金银花的质量做出了较全面、准确地评价,具有数学概念简单、数据处理比较简便、快速等特点,能有效地将正品与代用品分开。
参考文献:
[1]国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部[S].北京: 化学工业出版社, 2005:152.
[2]石钺, 石任兵, 陆蕴如.我国药用金银花资源及药理研究进展[J].中国中药杂志, 1999, 34(11): 724.
[3]于生兰, 张龙, 孙玲. 金银花的研究进展[J].时珍国医国药, 2002, 13(8): 498.
[4]庄恒扬, 沈新平, 陆建飞, 等. 模糊聚类计算方法的理论分析[J].江苏农学院学报, 1998, 19(3): 37.
[5]谢季坚, 刘承平. 模糊数学方法及其应用[M].武汉: 华中科技大学出版社, 2001:58.
(西安医学院,陕西 西安710068;延安大学附属医院,陕西 延安716000)