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       【关键词】  战骨；,,黄毛豆腐柴；,,指纹图谱；,,高效液相色谱法；,,壮药
       摘要：目的采用高效液相色谱法对壮药战骨药材进行指纹图谱的研究，为战骨药材质量标准的提升提供实验依据。方法实验采用Phenomenex Gemini C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.05 mol/L 醋酸水溶液为流动相进行二元梯度洗脱，流速1.0 ml / min，柱温25℃，检测波长274 nm。结果以23个共有峰为评价指标，精密度和重复性实验中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，符合有关规定要求。结论此方法操作简单，精密度、稳定性和重复性良好，有助于战骨药材的质量控制。
       关键词：战骨；  黄毛豆腐柴；  指纹图谱；  高效液相色谱法；  壮药
       Study on Fingerprint Chromatograms of Zhangu by High Performance Liquid Chromatography
       LI Xiaoyan,   YANG Lifang, Deng Guanghui, LUO Weiqiang, PAN Hongping, WEI Dongping
       （College  of  Chemistry and Ecological Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006，China； People"s Hospital of Guangxi Zhuang Nationality Autonomous Region, Nanning 530021，China）
       Abstract：ObjectiveThe fingerprint chromatograms were established for quality evaluation of traditional Zhuang nationality medicine Zhangu ( the root of Premna fulva craib)  by high performance liquid chromatography. MethodsThe analysis was performed on a Phenomenex Gemini C18 column（4.6 mm×250 mm,5 μm） with acetonitrile0.05 mol/L ethanoic acid  as mobile phase in a gradient mode at a flow rate of 1.0 ml/min, and at a column temperature of 25℃. The detection wavelength was 274nm. ResultsTwenty three peaks were selected as the common fingerprint peaks. The relative standard deviations for relative retention values and relative peak areas were less than 3% in the precision and repeated test. ConclusionThe method is reliable and can be helpful in the quality control of Zhangu.
       Key words：Zhangu；  Premna fulva Craib.；  Fingerprint；  High performance liquid chromatography；  Traditional Zhuang Nationality medicine
   
　　壮药战骨是马鞭草科植物黄毛豆腐柴 Premna fulva Craib.的干燥茎，别名土霸王、穿云箭［1］。多分布于广西百色、南宁地区等地，药源丰富，价廉易采收，属可持续利用的天然药物资源。战骨具有活血散淤、强筋健骨、驱风止痛的功效，广西民间常用于治疗腰腿痛、跌打损伤、风湿性和类风湿关节炎及感冒身痛、淋巴结炎、肝区疼痛等［2～4］。战骨中含有多种化学成分，其主要有效成分为柚皮素等黄酮类化合物［5～7］。由于受产地、气候、生态环境等因素的影响，不同药材所含有效成分差异较大。针对中药材的某个有效成分对药材进行定性、定量并不能有效控制中药材的质量。指纹图谱能够从综观和整体上表征中药材的特征，目前已成为国际上公认的控制天然药物质量的有效手段［8，9］。本文以提高战骨药材质量标准，促进民族医药发展为目的，对广西不同产地战骨药材进行了指纹图谱的研究。
       　　1  材料与方法
       1.1   仪器与药品仪器：美国PerKinElmer公司Series 200高效液相色谱仪（包括Series 200紫外检测器、Series 200二元泵、600 Series 接口及色谱工作站）。  Phenomenex Gemini C18 色谱柱（4.6 mm ×250 mm,5 μm）。药材：战骨（产地：广西，经广西南宁食品药品检验所中药室鉴定，均为马鞭草科植物黄毛豆腐柴的干燥茎。来源见表1）。试剂 ：乙腈、甲醇为色谱纯，乙醇、醋酸为分析纯，水为高纯水，柚皮素对照品（中国药品生物制品检定所）。
       表1  战骨药材样品来源及批号（略）
       1.2  色谱条件以乙腈-0.05 mol /L 醋酸水溶液为流动相进行二元梯度洗脱，流速1.0 ml/min，柱温25℃，检测波长274 nm，进样量20 μl。梯度洗脱程序结果见表2。
       表2   流动相梯度洗脱程序（略）
       1.3  方法
       1.3.1  参照物溶液的制备取柚皮素对照品适量，用甲醇溶解，定容，作为参照物溶液（含柚皮素104 μg/ml）。
       1.3.2  供试品溶液的制备取各批战骨药材粉未（过2号筛）约2.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入30%乙醇溶液50 ml，超声处理1.5 h ，放冷，再称定重量，用30%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。不立即分析的样品可暂存于4℃的冰箱保存。
       1.3.3  测定方法分别精密量取参照物溶液和各供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录90 min色谱图即得。以柚皮素的色谱峰（S）的保留时间和峰面积为1，计算其它各峰的相对保留时间和相对峰面积比值。
       　2  结果
       2.1  方法学考察
       2.1.1  精密度以1# 药材制备供试品溶液，在“1.2”项下色谱条件下，连续进样5次，检测指纹图谱。结果表明，色谱图中各色谱峰的相对保留时间的RSD小于0.98%；相对峰面积的RSD小于2.31%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。
       2.1.2  重复性以1# 药材5份，制备供试品溶液，分别检测指纹图谱，结果表明各色谱峰的相对保留时间的RSD小于1.91%；单峰面积大于等于5%总峰面积的色谱峰其相对峰面积的RSD小于2.28%，表明方法的重复性良好。
       2.1.3  稳定性取1# 药材制备供试品溶液，分别在0，12，17，37，48h 检测指纹图谱，结果表明，各主要色谱峰的相对保留时间的RSD小于2.51%，相对峰面积比值的RSD小于2.89%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
       2.2  指纹图谱的建立及分析
       2.2.1  指纹图谱及共有峰的标定对10个战骨药材样品进行了测定，其色谱图有23 个主要的共有特征峰（占总峰面积的90%以上）。其典型的HPLC-UV指纹图谱见图2。其中17 号峰为柚皮素（与参照物对照确认，色谱图见图1）。10批样品中，单峰面积与总峰面积的比值大于20%的共有峰只有17号峰，大于10%的共有峰有21 号峰，大于5%的共有峰有1号和4号峰。结果表明1，2，3………23号峰在10批样品的色谱图中均出现。以柚皮素对照品保留时间为参照，计算各共有特征指纹峰的相对保留时间，相对保留时间的RSD小于2.10%（n=10，结果见表3）。因此标定此 23个峰为共有指纹峰，并据此建立战骨药材的HPLC指纹图谱。
       表3  10批战骨药材共有指纹峰的相对保留时间（略）
       2.2.2  共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值以柚皮素峰面积为参照，计算各批药材供试品共有指纹峰的峰面积比值，结果见表4。由表4和图3可见，各批供试品指纹图谱的重现性较好，但各批样品间共有指纹峰的相对峰面积有一定差异。
       2.2.3  非共有峰面积供试的10批样品共有指纹峰面积之和占总峰面积比值平均为93.69 %，则非共有峰面积占总峰面积的比值平均为6.31 %，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》［10］。
       2.3   指纹图谱的检验取10批战骨药材，按供试品溶液的制备方法操作，分别取各批药材制成的供试品溶液，按供试品检测法进行检测，并与典型的指纹图谱相比较，结果表明各批样品指纹图谱相似度较好，共有23个共有峰，而且各共有峰的相对保留时间的RSD均小于3%。结果见图3及表3。 
       　　3  讨论
       3.1   实验过程中选择了多种流动相系统：①甲醇-水，②甲醇-醋酸水溶液，③乙腈-水，④乙腈-醋酸水溶液等度和梯度洗脱几种方式，并对梯度洗脱程序进行优化，结果表明以“1.2”项下系统为最佳。各色谱峰分离度较好，峰型尖锐，保留时间适中。
       3.2   实验中对战骨药材供试品溶液进行紫外扫描，在274 nm和280 nm有最大吸收。分别在254，274，280 nm和288 nm［11］波长下测定指纹图谱，从色谱图中的基线、峰型和分离度等因素综合考虑，选择274 nm为指纹图谱的检测波长。
       表4  10批战骨药材共有指纹峰的相对峰面积（略）
       3.3   不同产地的战骨药材指纹图谱相似度较高，23 个共有峰相对保留时间符合程度较好，但相对峰面积有一定差异。提示药材应在固定产地的前提下才能保证药品的一致性，同时说明以简单测定一个或几个成分含量为主的传统质量控制方法已不能真正反映中药材质量，而利用指纹图谱对药材进行综合、宏观地评价是当今对天然药物质量控制的有效手段。
       3.4   本实验所建立的方法，精密度、稳定性和重复性符合指纹图谱研究的技术要求［10］，为壮药战骨及制剂的质量控制提供了一定的科学依据，对壮药战骨药材质量标准的提升进行了有益的探索。
       图1   柚皮素HPLC图谱（略）
       图2  战骨药材HPLC指纹图谱（样品1#）（略）
       图3  10批战骨药材HPLC指纹图谱（略）
       　　参考文献：
       ［1］  广西壮族自治区卫生厅.  广西中药材标准，1990年版［S］.南宁：广西科学技术出版社， 1992：72，247.
       ［2］  潘洪平.黄毛豆腐柴化学成分，药理研究及临床应用进展［J］.广西医学, 2002，24（3）：365.
       ［3］  林  军，杨  斌 ，陈家欢，等.黄毛豆腐柴茎提取物改善微循环，保      护坐骨神经和软组织损伤的实验研究［J］.广西医科大学学报, 2001，18（2）：207.
       ［4］  蒋才武，曾春辉，刘寿养.壮族药战骨的性状与显微鉴别［J］.中药材, 2004，27(11)：811.
       ［5］  韦  松，思秀玲，曾  诠，等.黄毛豆腐柴化学成分的研究［J］.华西药学杂志,1988，3（1）：41.
       ［6］  曾  诠，刘成其，刘利根.黄毛豆腐柴茎皮酯溶性化学成分研究［J］.中国药科大学学报，1989，20（2）：94.
       ［7］  曾  诠，刘成基，孟宝华. 黄毛豆腐柴茎皮醋乙酸乙酯部分的化学成分研究［J］.中草药，  1990，21（5）：8.
       ［8］  谢培山.中药色谱指纹图谱［M］.北京:人民卫生出版社,2005:13.
       ［9］  周玉新.中药指纹图谱研究技术［M］.北京：化学工业出版社，2002：5.
       ［10］  国家药品监督管理局.中药注射剂指纹图谱研究技术要求［J］.中成药，2000，22（10）：671.
       ［11］  国家药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准・中药成方制剂，第14册［S］.北京：化学工业出版社，1998：138.
       基金项目：广西壮族自治区教育厅科学基金资助项目(No.［2004］20号)
       (广西民族大学化学与生态工程学院，广西 南宁  530006；广西壮族自治区人民医院 ，广西 南宁  530021)