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       【关键词】  板蓝根；,,流感病毒；,,淋巴细胞；,,红细胞免疫黏附；,,抗病毒作用
       摘要：目的研究板蓝根提取物对小鼠机体免疫功能的影响及其抗流感病毒(FM1)的作用。方法昆明种小鼠腹腔注射板蓝根提取液，检测红细胞免疫黏附功能等各项免疫指标;昆明种小鼠滴鼻感染流感病毒FM1后腹腔注射板蓝根提取液，观察板蓝根提取液的抗病毒作用。结果与正常对照组相比，板蓝根组脾指数增加（P ＜0.05）；T、B淋巴细胞刺激指数、RBCC3bR花环阳性率都明显增高，RBCIC花环阳性率显著降低，有显著性差异（P＜0.01）。与阴性对照组相比，板蓝根组肺指数降低（P＜0.05），体重增加值高（P ＜0.05)。结论 板蓝根提取物具有很强的增强机体免疫功能的作用，其提高红细胞免疫系统功能的作用极其显著；同时板蓝根提取物也有一定的抗流感病毒作用。
       关键词：板蓝根；  流感病毒；  淋巴细胞；  红细胞免疫黏附；  抗病毒作用
       The Effects of Radix Isatidis on Immunological Function and Influenza Virus (FM1) in Kunming Mice
       JIN Mingzhe,  REN Dongxian, MENG Fanping, LI Xiaomian
       (Bioimmunology Institute of Yanbian University, Yanji 133000, China)
       Abstract：ObjectiveTo study the strengthening function of extract of Radix Isatidis on immune system in Kunming mice and its antiviral effects on influenza virus (FM1). MethodsExtract of Radix isatidis was intraperitoneally injected to Kunming mice. Lymphocyte proliferation assay and rosette formation test were used to measure the cellular immune function and humoral immune function and erythrocytic immune adhesive function of mice. FM1 virus was dropped nasally in Kunming mice, then the animals were control intraperitoneally injected extract of Radix isatidis, the antiviral effects of Radix isatidis were observed.ResultsCompared with control group,spleen index in the Radix Isatidis group increased（F=4.578, P ＜0.05）. Compared with control group, SI of T lymphocyte in the Radix Isatidis group increased significantly（F=15.537, P ＜0.01）, SI of B lymphocyte  increased obviously（F=11.050, P ＜0.01）, and the rate of RBCC3bR was increased（F=7.865, P ＜0.01）, too. Compared with control group the rate of RBCIC in the Radix Isatidis group decreased greatly（F=20.354, P ＜0.01）. Compared with negative group, Lung index in the Radix Isatidis group decreased（F=47.020, P ＜0.05）. The degree of change in weight of that group was higher than negative group（F=25.877, P ＜0.05）. ConclusionRadix Isatidis has strong strengthening function on immune system in Kunming mice, its enhancing function on red cell immune adherence (RCIA) is extremely significant. Moreover，it also has antiviral effects on influenza virus.
       Key words：Radix Isatidis;   Influenza virus;   Lymphocyte;   RCIA;   Antiviral effects
   
　　中药板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的根，性寒味苦，有清热解毒、凉血消肿的功效。随着国际上应用天然药物的热潮，板蓝根的药理活性及其有效成分得到了深入的研究，并引起了国内外学者的广泛关注，但是关于板蓝根制剂对红细胞免疫功能的作用却少有报道。1981年美国的Siegel［1，2］在前人研究的基础上提出了“红细胞免疫系统(RCIS)”的新概念。近20多年来国内外学者对红细胞免疫功能进行了大量研究，红细胞的免疫功能逐渐被人们所认识，红细胞免疫已成为近年来免疫学研究中的一个新课题。
       　　1  器材
       1.1    病毒流感病毒鼠肺适应株（FM1），由天津医科大学微生物实验室培养提供。
       1.2  鸡胚9～11日龄鸡胚，购于天津市羽丰种鸡场。
       1.3  药品注射用胸腺肽：辽宁天龙药业有限公司，批号：国药准字H20003786；盐酸吗啉胍片（病毒唑）：山西津华药业有限公司，批号：国药准字H14023058；板蓝根提取液：安徽产板蓝根,以70%乙醇渗漉法提取。
       1.4   动物 昆明种小鼠（雄），14～16 g，北京大学医学部实验动物科学部提供,许可证编号：scxk(京)20020001。
       1.5   试剂刀豆蛋白（ConA）：sigma分装，批号：C2010；脂多糖（LPS）：sigma分装，批号：L2880； MTT：sigma分装，批号：M2128；RPMI1640培养基干粉：Gibco分装,批号：1181499；新生牛血清（NCS）：HyClone分装，批号：AJM11171。
       1.6  仪器二氧化碳培养箱，美国Forma Scientific公司；酶标光度计，美国BIORAD公司；电子天平，日本A&D 公司；B600超低速自动平衡离心机，白洋离心机厂；LDZ52平板离心机，北京医用离心机厂；SHP250B生化培养箱，天津天宇机电有限公司。
       　　2  方法
       2.1   FM1的培养及其LD50的测定［3］    9～11日龄鸡胚30枚，采用尿囊腔接种法培养繁殖流感病毒，滴定血凝效价，将血凝效价为1:640的鸡胚尿囊液收集在一起，作为本次实验使用的FM1原液。将FM1原液十倍倍比稀释，得到101，102，103，104，105浓度的病毒液。取昆明种小鼠50只，随机分5组，10只/组，乙醚轻度麻醉后，各组分别滴鼻给予以上5种浓度的病毒液50 μl，观察14 d，统计各组死亡数。结果见表3。使用ReedMuench法测得此流感病毒的LD50为10－3.2。
       2.2   板蓝根提取液增强机体免疫功能的作用
       2.2.1   动物分组及给药方法  昆明种小鼠30只，随机分3组，10只/组，给药方法见表1。给药 7 d后，先禁食、水8h以上，称重后摘眼球放血处死，收集血液，并无菌解剖取胸腺和脾脏，测定胸腺指数和脾指数，检测脏器比［4］、细胞免疫功能、体液免疫功能和红细胞免疫功能等多项免疫指标。
       胸腺（脾）指数＝胸腺（脾）重量     小鼠体重×100％
       表1  动物分组及给药方法（略）
       2.2.2   细胞免疫功能（T细胞增殖试验）［5～8］  常规制备5×106/ml脾细胞悬液备用。在96孔板上加脾细胞悬液100 μl/孔，每份设3个复孔，另设3个空白对照孔；再加20 μg/ml浓度的ConA50 μl，空白对照孔加RPMI1640培养液50 μl；用含10％NCS的RPMI1640培养液加至200 μl，使ConA的终浓度为5 μg/ml，置37℃，5％CO2温箱培养66 h；各加5 mg/ml的MTT10 μl，混匀后继续培养6h；加DMSO100 μl，充分混匀，静置10 min，用酶标光度计测波长570 nm的OD（光密度）值，以SI［6］（刺激指数）反映细胞增殖程度（结果见表4）：
       SI＝试验孔OD均值/对照孔OD均值
       2.2.3   体液免疫功能（B细胞增殖实验）［8，9］  在96孔板上加脾细胞悬液100 μl/孔，每份设3个复孔，另设3个空白对照孔；再加入100 μl浓度为 20 μg/ml的LPS作为刺激剂，LPS终浓度为10 μg/ml，空白对照孔则加RPMI1640培养液100 μl；然后置于 37℃，5％CO2温箱66 h；各加5 mg/ml的MTT10 μl，混匀后继续培养6 h；加DMSO100 μl，充分混匀，静置10 min，测波长570 nm的OD值，计算SI（结果见表4）。
       2.2.4    红细胞免疫功能（红细胞酵母菌花环试验）［10，11］  常规制备1.25×107/ml小鼠红细胞悬液和1×108/ml补体致敏的酵母菌细胞悬液备用。取两组小试管，每管加红细胞悬液100 μl，第1组试管加补体致敏的酵母菌悬液100 μl/管，第2组试管加未致敏的酵母菌悬液100 μl/管，摇匀，37℃水浴30 min；取出后轻轻摇匀，加0.9%生理盐水200 μl/管，混匀；再加0.25％戊二醛75 μl/管，摇匀；分别取1/3量水平涂片，吹干，加甲醛固定，瑞氏染色，油镜下计数。红细胞上黏附两个或两个以上酵母菌者为花环阳性，分别计数200个红细胞，计算出花环阳性细胞百分率，第1组为RBCC3bR花环，第2组为RBCIC花环（结果见表4）。
       2.3    板蓝根提取液抗流感病毒的作用［12～15］  昆明种小鼠40只，随机分4组，10只/组,分组及给药方法如表2。前3组小鼠乙醚轻度麻醉后，滴鼻感染10倍LD50浓度的FM1液50 μl；正常对照组则以0.9％生理盐水50 μl滴鼻。各组于感染24 h前开始腹腔注射不同药物，给药7 d后，禁食、水8 h以上，称重后断颈处死，解剖取肺脏，测定小鼠肺指数。
       表2  动物分组及处理方法（略）
       2.4  统计学处理方法  实验数据以±s表示，统计学处理方法上3组或4组数据之间采用SPSS11.5软件的OneWay ANOVA的方差分析方法进行统计分析。
       　　3  结果
       3.1  LD50测定结果见表3。
       表3   FM1的LD50测定（略）
       3.2  板蓝根提取液对机体免疫功能的影响  由表4可见，与1组相比，2组的脾指数略有增加（P ＜0.05）, 3组的脾指数明显增加（P ＜0.01）；2组、3组的T、B细胞刺激指数和RBCC3bR花环阳性率较1组都明显增高（P ＜0.01），而RBCIC花环阳性率都明显降低，存在显著性差异（P ＜0.01）；并且2组T细胞刺激指数比3组明显增强（P ＜0.01），有显著性差异（P ＜0.01）。胸腺指数3组之间无差异。
       表4  板蓝根提取液对机体免疫功能的影响（略）
       与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
       3.3    板蓝根提取液的抗流感病毒作用  由表5可见，与4组相比较，1组、2组、3组的肺指数显著降低（F=47.020, P＜0.01）。与1组相比，2组的肺指数较低（F=47.020, P＜0.05）；3组的肺指数明显低于1组,有显著性差异（F=47.020, P＜0.01）。与4组相比，1、2、3组的体重增加值显著增高（F=25.877, P＜0.01）。与1组相比，2组的体重增加值较高（F=25.877, P＜0.05）；3组体重增加值明显高于1组（F=25.877, P＜0.01）,有显著性差异。
       表5  板蓝根提取液对肺炎小鼠肺指数和体重增加的影响（略）
       与阴性药物对照组，正常对照组比较,*P<0.05；**P ＜ 0.01
       　　4  讨论
       《中国药典》1985，1990和1995版均只将十字花科菘蓝属植物菘蓝的干燥根收载作为正品板蓝根［16］。板蓝根的提取工艺［17］有多种，本次实验采用70%乙醇渗漉法［18］提取板蓝根液，此法能有效地减少提取过程中板蓝根靛蓝、靛玉红、多糖等有效成分的损失，避免加热时板蓝根中靛苷的水解和氧化，从而保证了板蓝根提取液中有效成分的含量。脾脏和胸腺是重要的免疫器官，脾指数和胸腺指数在一定范围内可以直接反映机体的免疫功能的强弱。淋巴细胞中，T、B细胞是主要的免疫活性细胞，ConA、LPS分别可以选择性的刺激T、B细胞使之增殖，其增殖的能力高低可直接反映机体免疫功能的强弱。由表4可见，板蓝根提取液能够有效地提高小鼠脾指数，对小鼠T、B细胞增殖反应有明显的增强作用，而且在增强小鼠T细胞增殖能力方面比胸腺肽注射液作用更明显，说明板蓝根提取液可以明显提高小鼠机体的免疫功能。FM1感染小鼠后，可以引发小鼠肺部炎性病变，导致小鼠肺组织充血水肿，质地变硬，使肺指数增高。由表5可见，板蓝根提取物能够缓解流感病毒引起的鼠肺炎症状，降低肺组织实变程度，具有一定的抗流感病毒的作用，但其作用没有阳性药物病毒唑显著。红细胞的免疫功能主要是藉助其膜上的蛋白质分子起作用的，红细胞膜上C3b受体可与补体致敏的酵母菌黏附形成RBCC3bR花环，红细胞膜上黏附的IC中的C3b分子可与未致敏的酵母菌黏附形成RBCIC花环。RBCC3bR花环率和RBCC花环率可作为红细胞免疫黏附功能的指标，如果二项指标都低下，判为原发性红细胞免疫功能低下，为红细胞膜C3b受体受到破坏和影响所致；如果RBCC3b受体花环率降低，而RBC-IC花环率增高，为继发性红细胞免疫功能低下，是由于循环免疫复合物增加，红细胞黏附IC过多引起。研究发现红细胞参与机体免疫调控，并有完整的自我调控系统。因此，红细胞的免疫功能可以看作是机体抗感染免疫的重要因素，是衡量机体免疫功能的重要指标。由表4可见，板蓝根提取液能够显著地提高小鼠红细胞的免疫黏附功能，且其作用同胸腺肽注射液相比较无差异。中药板蓝根作为清热解毒药具有悠久的历史。通过本实验研究表明，中药板蓝根具有明显增强小鼠免疫功能的作用，并且板蓝根提取液对提高小鼠红细胞免疫功能作用显著，同时中药板蓝根也具有一定的抗流感病毒功能。因中药的抑菌、抗毒作用机制不同于抗生素，不易使细菌和病毒产生耐药性，而日益受到关注。中药板蓝根作为临床上一种重要的抗病毒中药，我们应积极发现其新的药理作用，开拓其新的药用价值，并指导临床合理使用中药协同抗生素治疗机体微生物感染，对减少细菌和病毒耐药性的产生也有着积极的现实意义。
       　　参考文献：
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       （延边大学基础医学院生物免疫研究所，吉林 延吉  133000）