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       【关键词】  脑缺氧；,,脑缺血；,,新生大鼠；,,清开灵；,,白介素-6；,,Fas-L蛋白
       摘要：目的探讨缺氧缺血脑损伤对新生大鼠HIBD脑皮质IL-6放射免疫浓度，Fas-L蛋白表达的影响，及清开灵对新生大鼠HIBD的干预治疗作用以及有关分子机制。方法建立HIBD动物模型后分为放射免疫法测定组和免疫组化测定组，每组又分为清开灵干预组、生理盐水对照组、假手术组，根据检测需要，在缺氧缺血后24 h，3 d，7 d作IL-6脑皮质匀浆放射免疫浓度测定、Fas-L蛋白免疫组化SP法测定。结果①脑皮质组织匀浆IL-6放射免疫浓度（pg/ml）假手术组、生理盐水组、清开灵干预组：24 h依次为50.1±6.2,56.3±7.1,51.3±6.8;3 d依次为50.6±6.4,250.3±11.2,78.1±8.3;7 d依次为51.4±6.6,345.7±12.3,81.2±9.2,生理盐水组与另两组分别比较,24 hP均＞0.05,无明显变化;3,7 d生理盐水组增加明显P<0.05)清开灵干预组降低明显P<0.05)。②③④左脑皮质Fas-L蛋白表达阳性率假手术组、生理盐水组、清开灵干预组：24 h依次为8.04±3.50,120.20±6.10,21.10±5.10;3 d依次为8.20±3.10，87.6±5.90,13.40±4.20;7 d依次为8.01±2.80,8.32±2.90,8.26±2.83;生理盐水组与另两组分别比较，7 dP均＞0.05，无明显变化；24 h,3 d增多明显（P<0.05），清开灵干预组降低明显（P<0.05）。结论①新生大鼠HIBD后24 h，3 d,7 d脑皮质IL-6含量逐渐增高。②清开灵能降低新生大鼠HIBD脑皮质IL-6的产生量。③新生大鼠HIBD后，结扎侧脑皮质fas-L蛋白表达增高。④清开灵能抑制新生大鼠HIBD结扎侧脑皮质fas-L蛋白的高表达。
       关键词：脑缺氧；  脑缺血；  新生大鼠；  清开灵；  白介素-6；  Fas-L蛋白
       Effects of QingKaiLing on the Radioimmunologic Concentrations of IL-6, the Expression of Fas-L Protein in the Cortex in Neonatal Rats after Hypoxic-ischemic Brain Damage
       CHEN Jingguo, FANG Huiyun, JIANG Li, CHENG Minting
       (Dept. of Pediatrics, People"s Hospital of Zhongshan City, Zhongshan 528403, China; Dept. of Pediatrics of Zhongda Hospital, Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, China)
       Abstract：ObjectiveTo explore the immunologic changes of interleukin-6(IL-6), the expression of fas-L protein of cortex in newborn rats after HIBD and the effects of QingKaiLing on them.MethodsTo divide animals for experiment into groups: IL-6 test group: Animals were divided into sham group, NS group and QingKailing group, IL-6 radioimmunologic concentrations of cortex were measured at 24 h, 3d and 7d after hypoxia ischemia by radioimmunoassay. Immunohistochemistry group: Animals were divided into sham group, NS group and QingKaiLing group. The changes of expression of fas-L protein were detected at 24h, 3d and 7d after hypoxia ischemia by immunohistochemistry.ResultsComparing with the sham group, the concentration of IL-6 and the expression of fas-L protein (at 24h, 3d and 7d) increased obviously in the ligated side of the brain cortex in NS group (P＜0.05 . Comparing with NS group, they were on the contrary in QingKaiLing group(P＜0.05）.ConclusionThe concentration of IL-6, the expression of fas-L protein become higher rapidly after HIBD. QingKaiLing can inhibit the production of IL-6 and the expression of fas-L protein.
       Key words：Cerebral-hypoxia;  Cerebral-ischemia;  Neonatal rats;  QingKaiLing;  IL-6;  Fas-L protein
   
　　新生儿缺氧缺血性脑损伤（neonatal hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是围生期中的胎儿或新生儿由于各种因素引起的缺氧缺血，脑血流减少或暂停而导致的一种疾病，是窒息后的严重并发症，是导致儿童神经系统伤残的常见原因之一，严重的缺氧缺血性脑损害可产生永久性神经系统缺陷，如脑瘫，智力低下，学习障碍，癫痫等［1］。由于西药毒性作用大，疗效不肯定。我们试图从我国中药宝库中寻找治疗HIBD的有效药物，观察其疗效和作用机制，现将研究报告如下。
       　　1  材料与方法
       1.1  动物由东南大学医学院实验动物中心提供同窝7日龄Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，平均体重约12.0~15.8 g。
       1.2  试剂
       1.2.1  IL-6放射免疫检测试剂盒：购自天津九鼎生物工程有限公司。
       1.2.2  Fas-L免疫组化染色试剂盒：由武汉博士德生物工程有限公司提供。
       1.2.3  清开灵注射剂：购自山西太行山制药厂。
       1.3  方法
       1.3.1  围生期HIBD动物模型的制作按照Rice方法，取出生7日龄的SD大鼠。乙醚吸入麻醉1~2 min后仰卧，四肢固定于手术板上，做颈正中切口游离左侧颈总动脉，4号手术线结扎左颈总动脉，缝合切口，于原饲养环境恢复2.5 h后放入缺氧舱容器中，该容器中连续灌入37℃恒温水，以1.5 l/min的速度输入8%O2，92%N2混合气体，持续2.5 h。
       1.3.2  实验动物分组处理72只新生大鼠（7日龄）随机分为3大组，每组24只，每大组分为3个时间点小组：24 h，3 d和7 d，每小组8只，一大组为清开灵干预组，首先用Rice方法建立新生大鼠HIBD模型，于结扎左侧颈总动脉后恢复2.5 h，缺氧后腹腔注射清开灵10 ml/kg/d，分别于24 h，3 d和7 d断头取脑，用左侧脑皮质匀浆作IL-6放射免疫浓度测定，二大组为生理盐水对照组，基本方法如上，生理盐水腹腔注射剂量为10 ml・kg-1・d-1，3大组为假手术组，单纯游离左侧颈总动脉不结扎，不缺氧，其余方法如上。免疫组化测定：72只7日龄新生大鼠分组实验方法如上，于每一时间点取脑，中性甲醛固定脱水，透明，包埋和切片，采用免疫组化SP方法染色，检测各组皮质部位fas-L蛋白的表达。
       1.4  结果统计分析各项检测指标均以±s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析，和q检验，结果P＜0.05为差异有统计学意义。
       　　2  结果
       2.1  脑皮质IL-6放射免疫浓度测定结果在实验中观察到：与假手术组相比，生理盐水对照组脑皮质组织匀浆IL-6的放射免疫测定浓度在24 h无明显变化，3 d，7 d，IL-6增高明显(P<0.05)；与生理盐水对照组相比，清开灵干预组脑皮质组织匀浆IL-6的放射免疫测定浓度在24 h无明显变化，3 d，7 d IL-6的放射免疫测定浓度降低明显(P<0.05)。结果见表1。
       表1  3组新生大鼠HIBD脑组织皮质部位IL-6放射免疫浓度(略)
       与假手术比较，*P＜0.05，与生理盐水对照组比较，△P＜0.05；n=8
       2.2  脑组织皮质部位Fas-L免疫组化检测结果染成棕黄色的细胞为阳性细胞，实验中观察到，与假手术组相比，生理盐水对照组结扎侧脑皮质部位Fas-L在蛋白水平上在7 d变化不大，24 h,3 d表达明显增高（P<0.05〉，与生理盐水对照组相比，清开灵干预组在24 h,3 d表达增高不明显（P<0.05），在7 d变化不大（P>0.05）。结果见表2。
       表2  3组新生大鼠HIBD脑组织皮质部位Fas-L蛋白表达阳性率(略)
       与假手术比较，*P＜0.05，与生理盐水对照组比较，△P＜0.05；n=8
       　　3  讨论
       在中枢神经系统内，IL-6主要由胶质细胞产生，包括小胶质细胞和星形胶质细胞。脑缺血及缺血再灌注后小胶质细胞迅速激活，增殖，并聚集于损伤部位。小胶质细胞激活在脑缺血再灌注中的作用具有双重性。一是神经营养作用，可转化为吞噬细胞，吞噬死亡神经细胞残骸和变性的神经突触，合成新的神经结构；分泌IL-6，α干扰素，转化生长因子（TGF）β，胰岛素样生长因子-1和碱性成纤维细胞生长因子等神经营养因子，促进组织修复，支持神经元的存活。二是神经细胞毒性作用，通过与神经细胞的直接接触，胞内吞噬神经细胞，另外释放，分泌一系列潜在的神经毒性物质和炎性因子，如氧自由基、超氧化物等而致脑损害［2］。星形胶质细胞具有抗原呈递和分泌细胞因子等作用。最新研究表明缺血可诱导星形细胞的坏死与凋亡，正常情况下星形细胞IL1α，IL6与TNFα等细胞因子的mRNA表达水平很低，但在缺血时则表达显著增加；而且这些细胞因子的表达水平与缺血时间有关，在脑缺血后IL1α最先表达，TNFα次之，IL6表达最晚［3，4］。此前国外已有人作过脑组织IL-6 mRNA及其蛋白表达的研究与此结论相符。IL6是一种重要的细胞因子。有实验［5］将IL6直接注射至大鼠脑内，可明显减轻缺血性脑损害的体积，表明IL6对HIBD脑组织有保护作用。 有研究［6］表明，缺氧缺血可导致神经细胞的坏死， 亦存在凋亡过程发生，有关“凋亡基因”的改变已引起人们的关注，Fas及其Fas-L就是其中的“凋亡基因”的一部分。Fas-L多肽是一种35KD膜表面受体蛋白，由319个氨基酸组成，Fas-L蛋白胞浆区的一段60~70个氨基酸序列与TNF受体高度同源，对介导细胞死亡是必须的，称为死亡域,Fas-L蛋白复合三聚体具有诱导凋亡的能力，并通过死亡域间的相互作用促进Fas-L蛋白聚合而传导死亡信号，激活转录因子NF-KB，启动靶细胞内的凋亡程序。实验显示Fas-L蛋白表达增多时，凋亡明显可见，干预治疗后Fas-L蛋白表达减少，说明Fas-L与凋亡密切相关。还观察到Fas-L蛋白表达高峰时间较前，后逐渐减少，这说明它引起凋亡的作用时间较早。本实验研究表明Fas-L蛋白在正常新生大鼠脑内弱表达，缺氧缺血后病变部位出现散在分布的强阳性细胞，多是凋亡脑细胞，表明Fas-L与脑细胞凋亡有直接的关系，Fas-L参与了脑细胞凋亡的过程，Fas-L的作用是HIBD的发病机制之一。经干预治疗后，Fas-L的蛋白表达减少。说明早期干预阻抑了脑细胞的凋亡进程，对神经组织有明显的修复保护作用。另外在实验结果中，我们观察到脑损伤后随着时间的推移，Fas-L的蛋白表达明显减少，显示Fas-L参与凋亡的作用时间较早。中药清开灵注射液是在《温病条辨》安宫牛黄丸的基础上研制而成的一种纯中药复方针剂，其主要成分有：牛黄、水牛角、珍珠母、黄芩、栀子、金银花、板蓝根等。研究表明，清开灵注射液具有改善脑循环，抑制血小板聚集，降低血黏度抑制过氧化脂生成，抗自由基［7］，对抗兴奋性氨基酸对脑组织损伤［8］等作用。动物实验也证实，清开灵对缺血性［9］及感染性 ［10］脑损伤均有保护作用。但其抗脑损伤的具体机制尚未完全清楚，有动物实验显示清开灵可影响脑内乙酰胆碱酯酶活性和谷氨酸含量［11］，提示清开灵的作用机制可能与脑内中枢神经递质有关。本实验结果显示，清开灵它能明显减少脑组织IL-6的分泌，能抑制新生大鼠HIBD结扎侧脑皮质fas-L蛋白的高表达，对缺氧缺血脑损伤有重要康复作用。
       　　参考文献：
       ［1］  金汉珍，黄德珉，官希吉.实用新生儿学，第2版［M］.北京：人民卫生出版社，2000：624.
       ［2］  刘  敬，秦振庭.新生儿缺氧缺血性脑病的免疫学机制［J］.国外医学儿科学分册，2001，28（4）：175.
       ［3］  Yu AC, Lan LT. Expression of interleukin-1alpha, tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 genes in astrocytes under ischemic injury［J］. Neurochem Int , 2000，26(4/5):369.
       ［4］  Martin-Ancel A, Garcia-Alix A, Pascual-Salcedo D, et al. Interleukin-6 in the cerebrospinal fluid after Perinatal asphyxia is related to early and late neurological manifestations［J］. Pediatrics, 1997, 100(5):789.
       ［5］  Lodhick SA, Tumbull AV, Rothwell NJ. Cerebral interleukin-6 in neuroprotective during permanent focal cerebral ischemia in the rat［J］.J cereb Blood Flow Metab, 1998,18(2):176.
       ［6］  蒋  犁，汤云珍，黄晓明，等.缺氧缺血大鼠脑细胞凋亡的研究［J］.中华医学杂志，1998，78（8）：567.
       ［7］  陈  奇.中成药名方药理与临床［M］.北京：人民卫生出版社，1998：366.
       ［8］  岳少杰，罗自强，邓世林，等.清开灵和654-2对谷氨酸神经毒性脑水肿的影响［J］.中草药，1999，30（5）：355.
       ［9］  钱仁义，赵  铎，杜玉铃.清开灵注射液治疗血管性痴呆50例临床观察［J］.中成药，1999，21（11）：577.
       ［10］  杨建化.清开灵注射液的临床应用［J］.中成药，1994，16（2）：20.
       ［11］  朱培纯，许  红，吴海霞，等. 清开灵（I）（II）号试射液对大鼠脑内蓝斑乙酰胆碱酯酶及单胺氧化酶的影响［J］.北京中医学院学报，1980,3：24.
       （广东省中山市人民医院  528403；  东南大学医学院附属中大医院，江苏 南京  210009 ）