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       【关键词】  高效液相色谱法；,,淫羊藿多糖；,,衍生化；,,单糖
       摘要：目的测定淫羊藿多糖(EPS)中单糖的组成及其摩尔比。方法将淫羊藿多糖样品用1 mol/L硫酸溶液降解成单糖后,用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮( PMP)衍生, 通过简化衍生方法,优化分析条件,采用反相高效液相色谱250 nm紫外检测和使用梯度洗脱,分离测定各单糖。结果淫羊藿多糖由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6种单糖组成，其物质的量之比为0.60∶0.74 ∶1.00 ∶0.29 ∶2.29 ∶1.43。结论   该改进后的衍生化方法以及优化的高效液相色谱法具有简单、快速、重现性好等特点,可用于淫羊藿多糖中单糖组成的测定。
       关键词：高效液相色谱法；  淫羊藿多糖；  衍生化；  单糖
       Analysis of Monosaccharide Compositions in Epimedium Polysaccharide by Precolumn Derivation HPLC
       RAO Jinhua, LIU Wenying, JIANG Jiayu
       (Department of Pharmaceutical Analysis,Chinese Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)
       Abstract：ObjectiveTo determine the monosaccharides in the Epimedium polysaccharide(EPS) and their molar ratio.MethodsThe Epimedium polysaccharide were hydrolyzed into monosaccharides with 1 mol/L sulfuric acid. The monosaccharide derivatives obtained with 1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone ( PMP) were separated by reverse-phase HPLC using a developed gradient elution process,and monitored by ultraviolet detector at 250 nm. ResultsSix monosaccharides derivatives were  isolated with high sensitivity, good resolution by  HPLC.  The Epimedium polysaccharide is composed of mannose, rhamnose, galacturonic acid ,glucose, galactose,  and arabonose,with a molar ratio of 0.60∶0.74 ∶1.00 ∶0.29 ∶2.29 ∶1.43. ConclusionThis method has accurate result  and good reproducibility and can be used to determine the monosaccharides in Epimedium polysaccharide.
       Key words：HPLC;  Epimedium Polysaccharide;  Derivation;  Monosaccharide
   
　　淫羊藿多糖(EPS) 是从小檗科植物淫羊藿Epimedium中分离得到的一种酸性杂多糖，含量约占生品的2 %［1］。淫羊藿多糖具有广泛的药理学活性，有免疫调节作用以及刺激骨髓DNA 合成、增强血小板聚集等作用［2］。目前有关淫羊藿多糖的研究报道大多为药理活性研究以及传统的硫酸-苯酚法、蒽酮-硫酸法测定含量［3］，其单糖组成迄今未见报道，而多糖的单糖组成分析是进行多糖质量控制和获取多糖基本信息的重要环节。多糖样品的单糖组成分析常用的方法包括薄层色谱法、气相色谱法和液相色谱法。薄层色谱法微量成分显色不明显而且重现性不好;气相色谱法操作繁杂、费时; 液相色谱法操作简单快速。本实验采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮( PMP)柱前衍生，高效液相色谱分离方法,对淫羊藿多糖中的单糖进行了组成分析。
       　　1  仪器与试药
       Agilent 1100 Series高效液相色谱仪，ChemStations色谱工作站。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，甲醇重结晶两次，上海化学试剂采购供应站试剂厂）；乙腈 (色谱纯,MERCK公司)。单糖对照品：葡萄糖（Glc，上海惠兴生化试剂有限公司）、阿拉伯糖（Arab，Sigma公司）、半乳糖（Gal，Amresco公司，北京经科公司分装）、鼠李糖（Rham，England B.D.H Laboratory Chemicals Group）、甘露糖（Mannose，Supelco公司）、岩藻糖（Fuc，Fluka公司）、半乳糖醛酸（GalUA，Fluka公司），其余试剂均为国产分析纯。淫羊藿多糖（EPS）由本实验室分离纯化,经紫外光谱分析,不含蛋白质和核酸类物质，红外光谱具有多糖特征吸收。
       　　2  方法
       2.1  色谱条件色谱柱为Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为溶剂A，15% （V/V）乙腈+ 20 mmol/L乙酸铵水溶液，溶剂B，40% （V/V） 乙腈+20 mmol/L乙酸铵水溶液；梯度模式：时间梯度为0 min→25 min，相应浓度梯度为0%→50%溶剂B。检测波长250 nm；流速1.2 ml/min；进样体积20 μl;柱温为室温。
       2.2  多糖的水解称取20 mg淫羊藿多糖置于安瓿管中,加入浓度为1 mol/L硫酸溶液2.0 ml,封管后于100℃水解6 h,得水解样品溶液。用2 mol/L氢氧化钠水溶液中和至pH值为7. 0,并以纯化水稀释到5.0 ml,离心,取上清液待衍生化。
       2.3  单糖标准品的衍生化取浓度分别为1.0 mmol/L的甘露糖(Man) 、鼠李糖(Rham) 、半乳糖醛酸(GalUA) 、葡萄糖 (Glc) 、半乳糖(Gal) 、阿拉伯糖(Arab)和内标岩藻糖(Fuc)的混合单糖对照品水溶液80 μl,置于具塞离心试管中。加入0. 25 mol/L的PMP甲醇溶液80 μl和0.2 mol/L的氢氧化钠溶液80 μl，涡旋30 s后置于70 ℃水浴中反应30 min,取出。冷却至室温后,加入0. 2 mol/L的盐酸溶液80 μl中和，涡旋30 s后用0.5 ml乙酸异戊酯萃取，涡旋3 min，离心，小心弃去上层有机层，再萃取1次得下层水层，加0.5 ml氯仿同法萃取1次，取上层水层20 μl进行HPLC分析。结果见图1。
       2.4  样品的衍生化取淫羊藿多糖水解液80 μl进行衍生化反应,步骤同“2.3”节。结果见图2。
       图1  单糖对照品衍生化产物的色谱图（略）
       图2  淫羊藿多糖水解样品衍生化产物的色谱图（略）
       2.5  多糖样品中的糖组成分析和计算方法按式(1)计算校正因子fx=( mx / Ax)/( mfuc / Afuc) 。(1)式中Ax、Afuc分别为对照品单糖x衍生物峰面积和内标衍生物峰面积，mx、mfuc分别为对照品溶液中单糖x和内标的浓度（mmol/L）。按式(2)计算样品中各种单糖的比例。 (2)m1:m2:m3:m4:m5:m6=(A1×f1) : (A2×f2) : (A3×f3) : (A4×f4) : (A5×f5) : (A6×f6)  式中m1，m2，m3，m4，m5，m6分别为样品溶液中单糖的量，A1，A2，A3，A4，A5，A6分别为单糖的衍生物峰面积，f1，f2，f3，f4，f5，f6为式(1)计算的单糖对内标相应的校正因子。
       　　3  结果
       3.1  标准曲线取5组不同浓度的标样混合溶液按2.3项下方法进行分析，记录色谱图，其浓度与峰面积积分值呈很好的线性关系，各单糖适用的浓度范围在0.25～2.5 mmol/L之间。结果见表1。
       表1  6种单糖的标准曲线（略）
       3.2  精密度取标准单糖混合溶液, 依前述衍生化和色谱条件，连续进样5 次, 甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖与岩藻糖峰面积之比的进样精密度（RSD，n=5）分别为0.41%，0.43%，0.70%，0.48%，0.24%，0.34%。 
       3.3  稳定性实验取淫羊藿多糖水解液衍生化后的溶液分别在0，2，4，8，12，24 h进样，记录峰面积，结果甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD（n=5）分别为1.61%，2.18%，5.00%，4.19%，2.36%，3.30%，表明样品溶液在24 h内稳定。
       3.4  重复性实验取淫羊藿多糖，依前述衍生化和色谱条件，重复测定该样品溶液6次，结果甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD（n=5）分别为0.77%，0.21%，2.44%，3.87%，2.70%，2.80%。
       3.5  多糖样品分析将混合单糖标准品图谱与淫羊藿多糖的图谱对照,可以确定淫羊藿多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5种中性单糖和半乳糖醛酸1种酸性单糖组成，采用校正因子计算单糖组成比例，样品可不加内标进行衍生化HPLC分析。根据分析和计算方法,求得淫羊藿多糖中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖之间的摩尔比为0.60∶0.74 ∶1.00 ∶0.29 ∶2.29 ∶1.43。
       　　4  讨论
       4.1  衍生化条件的改进Honda等［4］首次将具有强紫外吸收的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)用于糖类物质的衍生。与已有文献不同,本文没有对衍生化中和后的水相进行干燥。该步骤的简化并没有影响衍生物的性质,也没有产生任何影响分离的杂质,而且在一定程度上缩短了反应时间,降低了反应产物在多个步骤中的损失。PMP色谱峰位在10.5 min,而保留最弱的甘露糖色谱峰位于13 min，PMP与各单糖组分离良好，不影响单糖的测定。
       4.2  缓冲液的选择与色谱梯度模式的优化本实验以如下3 种分离条件为基础：(1) 溶剂A，15% （V/V） 乙腈+pH7.0磷酸盐缓冲液，溶剂B，40% （V/V） 乙腈+pH7.0磷酸盐缓冲液；梯度模式：时间梯度为0 min→9 min→28 min，相应浓度梯度为0%→10%→65%溶剂B［5］。（2）溶剂A，15% （V/V）乙腈+ 20 mmol/L乙酸铵水溶液，溶剂B，40% （V/V） 乙腈+20 mmol/L乙酸铵水溶液；梯度模式：时间梯度为0 min→20 min，相应浓度梯度为0%→60%溶剂B。（3）溶剂A，15% （V/V）乙腈+ 20 mmol/L乙酸铵水溶液，溶剂B，40% （V/V） 乙腈+20 mmol/L乙酸铵水溶液；梯度模式：时间梯度为0 min→25 min，相应浓度梯度为0%→50%溶剂B。将以上梯度程序用于考察单糖混合对照品的分离。在实验中发现: 在条件(1)磷酸盐缓冲液作流动相时,鼠李糖（Rha）峰形不好，半乳糖（Gal）和阿拉伯糖（Arab）不能达到基线分离,经过梯度优化后，无明显改善；在条件 (2)时，甘露糖（Man）和PMP不能达到基线分离,说明梯度变化过快,不利于出峰最早的甘露糖分离；在条件(3)醋酸盐缓冲液作流动相时,通过合适的梯度洗脱,各单糖组得到较好的分离,分析时间在22 min以内。结果表明在本单糖体系中，醋酸盐缓冲液优于磷酸盐缓冲液系统。
       4.3  在单糖分析方法中气相色谱法分离单糖繁琐费时，易出现色谱峰异构化裂分；高效液相色谱法测定单糖可用糖分析柱和氨基键合相柱，但其价格昂贵，分析成本高［6］。本实验室采用价格较低的C18色谱柱，紫外检测器，通过对色谱条件的优化，可同时分离测定5种中性单糖，1种酸性单糖和1种内标单糖。本方法不仅可提供淫羊藿多糖的单糖组成的基本信息,且可推广应用到其他多糖组成的分析。
       　　参考文献：
       ［1］  杨武德, 胡高翔. 粗毛淫羊藿及其不同炮制品中多糖的测定［J］. 中草药， 2005，36（4）：543.
       ［2］  郭宝林，罗崇念，肖培根.  淫羊藿多糖研究进展［J］. 中国中药杂志，1998，23(7)：436.
       ［3］  陈鸿英, 朱永智, 吴乃居, 等. 朝鲜淫羊藿多糖的含量测定［J］. 中草药， 2003，34（9）：810.
       ［4］  Honda S, Akao E, Suzuki S,et al. High-performance liquid chromatography of reducing carbohydrates as strongly ultraviolet-absorbing and electrochemically sensitive 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatives［J］.Anal.Biochem.,1989,180:351.
       ［5］  马定远，陈  君，李  萍，等. 柱前衍生化高效液相色谱法分析多糖中的单糖组成［J］. 分析化学，2002，30（6）：702.
       ［6］  袁忠海，吴道澄，赵  燕，等. 高效液相色谱法测定魔芋精粉中葡甘露聚糖的含量及单糖组成［J］.中国中药杂志，2003，28（7）：621.
       (中国药科大学，江苏 南京  210009)