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       【关键词】  黄连；,,盐酸小檗碱；,,提取工艺；,,正交实验设计；,,荧光分析法
       摘要：目的考察乙醇回流提取法提取黄连中盐酸小檗碱时主要影响因素。方法通过正交实验法确立试验体系，采用荧光分析法测定盐酸小檗碱含量。结果选择不同的提取条件盐酸小檗碱提取率有显著差异。结论 最优提取工艺是：50%乙醇溶液、8倍体积、85℃回流提取2次，每次2 h。
       关键词：黄连；  盐酸小檗碱；  提取工艺；  正交实验设计；  荧光分析法
       The Studies of Extraction Process of Berberine Hydrochloride in Coptis Chinensis Franch.
       WU Jia, TAN Gui-lian, YANG Hong
 
　　(Yanjing Medical College, Capital University of Medical Sciences, Beijing,101300,China)
       Abstract：ObjectiveTo study the major influential factors of extraction by alcohol flowing on berberine hydrochloride in Coptis Chinensis Franch. MethodsTo establish the experiment system by orthogonal experimental design and adopt fluorometry to determine the content of berberine hydrochloride.ResultsWe observed the significant difference of the extraction rate of berberine hydrochloride under the different extraction conditions.Conclusion The optimum extraction process was achieved: the addition of 50% alcohol( 8 times raw herb in volume) into materials, refluxing and extracting for 2 times at 85℃.
       Key words：Coptis Chinensis Franch.;  Berberine Hydrochloride;  Extraction process;  Orthogonal experimental design;  Fluorometry
   
　　黄连为毛茛科植物黄连Coptis Chinensis Franch.的干燥根茎。《神农本草经》列为上品。性寒，味苦，具有清热燥湿，泻火解毒之功效。《中国药典》中黄连和盐酸小檗碱一直有收载，具有抗病原微生物、抗腹泻、抗炎和免疫促进以及降血压、抗心律失常、降血糖等药理作用，用于急性肠胃炎、口舌生疮、烧烫伤、心率失常、高血压、糖尿病等疾病的治疗。黄连中主要有效成分为小檗碱，为避免黄连中小檗碱在煎煮、浓缩过程中损失，中药复方制剂中的黄连常单独提取。常用的提取方法有稀硫酸渗漉法、乙醇回流提取法、超声提取法、连续回流法、煎煮法。本文主要讨论乙醇回流提取工艺中影响盐酸小檗碱提取率的主要因素。
       　　1  仪器与试药
       1.1  仪器  960型荧光分光光度计（上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂）；UVⅡ型三用紫外灯（北京智源通生物技术研究所）；UX220H型电子天平（岛津公司）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）等。
       1.2    试药黄连（购自北京市丰泰金源药业有限公司，生产批号050401，经鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.的干燥根茎）；盐酸小檗碱对照品（供含量测定用，批号：110713200208，中国药品生物制品检定所）；盐酸、乙醇、无水乙醇、苯、醋酸乙酯、异丙醇、甲醇均为分析纯；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）。
       　　2  方法与结果
       2.1   预试验，考察盐析条件按照预先选定的提取思路，称黄连粗粉20   g，50%乙醇回流提取，2 h/次，乙醇提取液浓缩后用浓盐酸调pH2，加入NaCl固体，充分搅拌使其完全溶解，放置过夜，抽滤，沉淀物用少量蒸馏水洗，于50～60℃干燥，得盐酸小檗碱粗品。考察NaCl用量对盐酸小檗碱粗品得率的影响（表1）。结果显示NaCl用量15%（W/V）时粗品得率最高，但此时溶液已达过饱和状态，干扰实验结果，且与浓度为10%时粗品得率无明显差异，故选择加入NaCl固体10%（W/V）为盐析条件。
       表1   盐酸小檗碱粗品得率（略）
       2.2  正交实验设计  以盐酸小檗碱得率为指标，根据预试结果选择乙醇浓度，乙醇用量，回流提取次数，回流温度4个因素，每个因素取3个水平。见表2。按L9(34)正交实验设计（表3）对提取结果进行考察。
       表2  因素水平（略）
       2.3    盐酸小檗碱含量测定
       2.3.1  测定波长的确定精密称取盐酸小檗碱标准品10 mg于100 ml容量瓶中，加入无水乙醇，50℃至完全溶解，冷却后定容，得盐酸小檗碱标准品溶液（0.1 mg/ml），以无水乙醇为空白溶液，固定激发波长（λex）365 nm，Sens=3,发射波长（λem）自260 nm至800 nm进行扫描，结果在525 nm获得最大荧光强度，因此将λex=365 nm，λem=525 nm，作为测定波长。
       2.3.2  标准曲线的制备分别精密量取2.3.1中盐酸小檗碱标准品溶液0.5 ，0.75 ，1，1.25，1.5，1.75，2 ml于250 ml容量瓶中，用无水乙醇定容，分别得浓度为0.2 ，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 μg/ml的标准品溶液，在2.3.1中确定的条件下测定荧光强度，得回归方程Y=9.032+90.679X，r=0.994。
       2.3.3   各提取物中盐酸小檗碱的含量测定 精密称取不同提取条件下的盐酸小檗碱粗品5 mg于50 ml容量瓶中，加入无水乙醇在50℃使全部溶解，冷却后定容。用微量注射器吸取6 μl点于硅胶GCMCNa薄层板（105℃活化30 min）上，用苯：醋酸乙酯∶异丙醇∶甲醇∶水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.3）为展开剂（展开槽中加等体积浓氨液预平衡15 min），盐酸小檗碱标准品溶液为阳性对照，展开，取出挥干溶剂，在紫外灯（365 nm）下检视，刮取盐酸小檗碱斑点用无水乙醇回流洗脱40 min，趁热抽滤，滤液冷却后定容至10 ml。按2.3.1中条件分别测定各提取物的荧光强度，计算盐酸小檗碱含量。见表3。
       表3   L9(34)正交实验设计及结果（略）
       2.4  回收率测定分别用微量注射器吸取盐酸小檗碱标准品溶液（0.1 mg/ml）4，6，8，10 μl点于硅胶GCMCNa薄层板（105℃活化30 min）上，以2.3.3中条件展开，洗脱，测定荧光强度，计算回收率。见表4，RSD=2.32%。
       表4  盐酸小檗碱标准品（0.1 mg/ml）回收率（略）
       *标注数字为层析点样点数
       表5   A1B2C2D2盐酸小檗碱提取率表（略）
       2.5  重现性考察以正交实验设计中A1B2C2D2为提取条件，提取并测定盐酸小檗碱提取率见表5，RSD=0.519%。
       　　3  讨论
       3.1   盐酸小檗碱在热水、热乙醇中溶解度较大，在冷水、冷乙醇中溶解度小，加入NaCl可以促进其析出结晶，且NaCl用量10%（W/V）最为理想。
       3.2   本实验采用正交实验设计，乙醇回流提取法提取黄连中盐酸小檗碱的最佳提取工艺为：50%乙醇，8倍体积，85℃回流提取2次，每次2 h。
       3.3   荧光分析法灵敏度高，选择性好，但易受外界因素（如温度等）影响，因此标准曲线的获得及各提取物含量测定工作在一次完成，数据更为可信。
       3.4   盐酸小檗碱层析洗脱后要迅速抽滤，否则样品损失严重。
       3.5   盐酸小檗碱的提取方法较多，但本人认为回流法较其他方法设备简单，耗时较短，成本低，提取率高，可以适用于生产及药学专业学生实习采用。
       （首都医科大学燕京医学院，北京  101300）