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       【关键词】  打箭菊；,,芦丁；,,紫外分光光度法；,,总黄酮；,,正交设计
       摘要：目的研究打箭菊总黄酮的最佳提取条件。方法以芦丁为指标，用紫外分光光度法对打箭菊总黄酮的提取方法进行系统研究。结果乙醇回流提取法最好，且以50%乙醇按1∶50的料液比、在100℃回流提取3 h的方法提取，得到的打箭菊中的总黄酮含量最高。结论 打箭菊中总黄酮的最佳提取条件为B3C3A2D3。
       关键词：打箭菊；  芦丁；  紫外分光光度法；  总黄酮；  正交设计
       Study on Extraction of Total Flavonoids in Traditional Tibetan Drug Flos Pyrethri Tatsienensis
       ZHANG Daoying, ZHANG Ling*，XU Huaiyuan
       (Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang， Jiangxi 330004，China)
       Abstract：ObjectiveTo study the optimum extracting condition of total flavonoids in Flos Pyrethri Tatsienensis. MethodsUsing Rutin as the evaluating criteria, the extraction condition was studied by ultraviolet spectrophotometry. ResultsThe optimum extracting condition was as follows：50% ethanol,solidliquid ratio 1∶50 and refluxing and extracting for 3 h at 100℃. ConclusionThe optimum extracting condition was B3C3A2D3.
       Key words：Flos Pyrethri Tatsienensis;   Rutin;   UV;   Total flavonoids;   Orthogonal design
   
　　打箭菊，又名鞑新菊或川西小黄菊，为菊科匹菊属（或小黄菊属）植物川西小黄菊Pyrethrum tatsienense(Bur.et Franch.) Ling (Chrysanthemum tatsienense Bur.et Franch.)的干燥头状花序［1］。生长于海拔3 500～5 000 m的高山草坡或灌丛林缘，分布于青海、四川、云南、西藏及甘肃等地，为一种常用藏药，其藏名为“阿加塞窘”“塞窘美多”。性寒，味苦，无毒。具有活血、散瘀、祛湿、消炎、止痛功能，其藏名“塞窘”就为解痛之意［2］。主要用于脑震荡、“黄水病”、瘟疫病、太阳穴头痛、跌打损伤和湿热疮疡。有文献报道，打箭菊中主要含有黄酮类、生物碱等成分［3，4］，但并没有人对其做深入的研究，也没有关于其主要成分提取分离的报道。本文首次以芦丁为指标，用紫外分光光度法对打箭菊中总黄酮的提取条件进行了系统的研究，为进一步开发利用打箭菊资源提供科学依据。
       　　1  器材
       U3000 Spectrophotometer(日本日立公司)；电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；SB3200超声波清洗仪(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；DZF6050型真空干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；X9146MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。芦丁对照品(中国药品生物制品检定所提供)；打箭菊药材购自西藏；所用试剂均为分析纯。
       　2  方法与结果
       2.1  样品提取
       2.1.1  冷浸提取取打箭菊粉末约1g，精密称定，置索氏提取器中，用乙醚回流脱脂至无色，将乙醚液弃去。待乙醚挥干后，将粉末置干燥箱中60℃干燥1 h，然后全部转移至250 ml具塞三角瓶中，加50%乙醇50 ml，冷浸过液，过滤，残渣用50%乙醇洗至无色，合并提取液与洗涤液，置水浴上挥干，用甲醇溶解，并转移至50 ml 容量瓶中，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得第1份溶液。
       2.1.2  回流提取取打箭菊粉末约1 g，精密称定，用乙醚回流脱脂预处理后，将粉末全部转移至150 ml平底烧瓶中，加50%乙醇50 ml，水浴回流提取1.5 h，过滤，其他操作同第1份。
       2.1.3  索氏提取取打箭菊粉末约1 g，精密称定，用乙醚回流脱脂预处理后，将粉末与称量纸筒一起放入索氏提取器中，加50%乙醇适量，连续回流至提取液无色，提取液置水浴上挥干，用甲醇溶解，并转移至50 ml 容量瓶中，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
       2.1.4  超声提取取打箭菊粉末约1g，精密称定，用乙醚回流脱脂预处理后，将粉末全部转移至250ml三角瓶中，加50%乙醇50ml，超声提取30 min，过滤，其他操作同第1份。
       2.2  总黄酮含量的测定
       2.2.1  对照品溶液的制备精密称取120℃减压干燥至恒重的无水芦丁20.9 mg，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶解(如不溶，置水浴上微热使溶解)，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液(每毫升含芦丁0.209 mg)。
       2.2.2  测定波长的选择及稳定性考察取4个25 ml容量瓶，1，2号分别加入2ml芦丁对照品溶液和1ml打箭菊溶液，各加甲醇稀释至刻度，以甲醇为空白，在紫外分光光度计上200～600 nm波长范围内进行扫描。3，4号分别加入2 ml芦丁对照品溶液和1ml打箭菊溶液，各加甲醇至6 ml，再加0.5 ml 2%三氯化铝甲醇溶液(含1%冰醋酸)，用甲醇稀释至刻度，摇匀，放置60 min，在200～600 nm波长范围内扫描［5，6］。从吸收图谱上可以看出，用2%三氯化铝甲醇溶液(含1%冰醋酸)显色后，在紫外区，打箭菊的吸收峰发生了紫移，而芦丁的吸收峰发生了红移，但它们的最大吸收波长发生移动后都在274.60 nm处。因此，可以确定274.60 nm为测定波长。同时在274.60 nm处进行时间扫描，显示在120 min内显色很稳定。
       2.2.3  标准曲线的制备精密量取芦丁对照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml，分别置于25 ml容量瓶中，各加甲醇至6ml，加入2%三氯化铝甲醇溶液（含1%冰醋酸）0.5 ml，摇匀，再加甲醇至刻度，放置60 min，以第1瓶中溶液作为空白，在274.60 nm测定各溶液的吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程：C＝0.0274A-0.000 1，相关系数r=0.999 9，其线性范围为0.004 2～0.021 0 mg/ml。
       2.2.4  样品的测定精密吸取各供试品溶液1ml，然后照“标准曲线的制备”项下操作，测定吸收度，由回归方程换算成总黄酮浓度，并计算出打箭菊中总黄酮的含量。
       2.2.5  结果比较比较结果可知，用回流提取法所得的溶液总黄酮含量最高，所以决定用回流提取法对打箭菊药材进行提取。
       2.3  正交实验设计
       2.3.1  考察因素及水平选择乙醇浓度、料液比、提取温度及提取时间4个因素，每个因素选择3个水平，编制L9（34）因素水平表［7］。见表1。
       表1  L9（34）因素水平表（略）
       2.3.2  正交实验方法取打箭菊粉末约14 g，置索氏提取器中，用乙醚回流脱脂至无色，乙醚提取液弃去，将粉末置干燥箱中60℃干燥1 h，取出，放冷，分别称取9份，每份约1 g，精密称定，置平底烧瓶中，然后按下面正交实验设计表2中的因素和水平［8］，精密加入规定浓度的乙醇，称重，回流提取，放冷后再称重，补足损失的溶剂量，摇匀后过滤，将初滤液弃去，精密量取续滤液5 ml，置水浴上挥干，残渣用甲醇溶解，并转移至50 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取各份溶液4 ml，然后照“标准曲线的制备”项下操作，测定吸收度，由回归方程换算成总黄酮浓度，并计算出打箭菊粉末中总黄酮的含量。
       表2  L9（34）正交实验设计与结果记录（略）
       2.3.3  结果分析用SPSS13.0对实验结果进行方差分析［9］。结果见表3。
       表3  方差分析（略）
       纠正模型统计量 F=284.852，P=0.000＜0.05，所选模型有统计学意义，其中A，B，C，D均是P=0.000＜0.05，说明它们对实验结果均有显著影响，其因素的主次顺序为：B→C→A→D。再由各因素的均数判断其最佳水平，其中A应选2水平，B，C，D均应选3水平，所以最佳实验方案为B3C3A2D3，即50%乙醇按1∶50的料液比、在100℃回流提取3 h。
       　　3  讨论
       3.1  分别用石油醚、乙醚对打箭菊粉末进行脱脂预处理，然后提取，并与不进行预处理直接提取所得溶液的总黄酮含量相比较。结果发现，不进行预处理所得溶液的总黄酮含量要低得多，而用乙醚处理比用石油醚处理所得的总黄酮含量更高。所以应该对打箭菊粉末进行脱脂预处理，且脱脂溶剂应选用乙醚。
       3.2  用正交实验对打箭菊总黄酮的提取条件进行全面优选，并对实验结果进行方差分析，发现4个因素即乙醇浓度、料液比、提取温度与提取时间均对实验结果有显著影响，且其主要影响因素为料液比，其次为提取温度、乙醇浓度和提取时间，最后得出最佳提取方案为B3C3A2D3。
       参考文献：
       ［1］  江纪武.　拉汉药用植物名称和检索手册［M］.北京：中国医药科技出版社.1990：1111.
       ［2］  周海钧.中国民族药志，第1卷［M］.北京：人民卫生出版社，1990：172，175.
       ［3］  张盍曾. 藏药研究资料［J］.中草药通讯，1973，5：71.
       ［4］  肖培根，夏光成.　藏药常用药物的整理研究［J］.新医药杂志，1973，6：39.
       ［5］  徐雷鸣，汪素兰. 紫外分光光度法测定百蕊草总黄酮含量［J］.基层中药杂志，1995，9(4)：29.
       ［6］  林维宣，孙学谦，佟绍芳. 紫外分光光度法测定山楂中总黄酮的研究［J］. 大连轻工业学院学报，1993，12(3)：45.
       ［7］  陈郑镔，陈炳华，刘剑秋，等.小蓬草总黄酮提取条件及含量测定［J］.福建师范大学学报(自然科学版)， 2004，20(1)：79.
       ［8］  张春华，周永治，刘延福.　数理统计方法［M］.济南：山东大学出版社，1995：248.
       ［9］  周仁郁.SPSS13.0统计软件［M］.重庆：西南交通大学出版社，2005：113.
       (江西中医学院，江西 南昌  330004)