文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【关键词】  清开灵；,,指纹图谱；,,高效液相色谱
       摘要：目的比较清开灵不同制剂的高效液相色谱指纹图谱。方法选择NUDEOSILC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相（A）甲醇（B）0.5% 醋酸梯度洗脱，运行时间65 min，检测波长255 nm，测定清开灵注射液的指纹图谱。结果以黄芩苷作为参照峰，得出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结论 清开灵不同制剂的指纹图谱相差较大，提示不同的生产工艺可能对其成分及含量有较大的影响。
       关键词：清开灵；  指纹图谱；  高效液相色谱
       Comparison of the Fingerprint Chromatogram of Different Preparations of Qingkailing by HPLC
       ZHANG Miaoyuan, YAO Jincheng*, ZHAO Xuyuan, HU Ling
       （The Department of Chest Surgery, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha  410011，China；National Center of New Drug Screening, China Pharmaceutical University, Nanjing 210038，China；Clinical Pharmacy Research Institute, the Second Xiangya Hospital of Central South University,  Changsha  410011，China）
       Abstract：ObjectiveTo compare the fingerprint chromatogram of different preparations of Qingkailing Compound. MethodsHPLC with NUDEOSIL-C18 column was used,the mobile phase was (a) methanol,（b）0.5% acetate buffer and the detection wavelength was at 255nm.ResultsPeaks were indicated on the HPLCfingerprint of different preparations of Qingkailing Compound. The relative retention time and relative peak area were obtained with itself peak.ConclusionThe fingerprint chromatogram of different preparations of Qingkailing Compound are noticeably different, which indicates different manufacture technology affects ingredients and contents of Qingkailing preparations.
       Key words：Qingkailing Compound;   Fingerprint chromatogram;   HPLC
   
　　清开灵组方源于中医治疗急性热病传统处方“温病三宝”中的安宫牛黄丸,由胆酸、猪去氧胆酸、水牛角粉、珍珠母粉、金银花提取物、黄芩苷、栀子、板蓝根等组成,迄今为止已经形成系列产品。临床效果显著,应用剂型主要有注射液、胶囊、颗粒、口服液。用于清热解毒、镇静安神、祛痰开窍。主治上呼吸道感染、病毒性感冒、急性化脓性扁桃体炎、急性咽炎、急性气管炎、高热等症。按国家药品监督管理局颁发的关于中药注射剂指纹图谱研究的技术要求［1］，本实验建立了合适的方法对清开灵不同制剂进行了指纹图谱的测定，并用中药指纹图谱相似度计算软件对其进行相似度的计算。
       　　1  仪器与试剂
       1.1  仪器岛津LC10A系列高效液相色谱仪（含 LC10ATVP泵， LC10Ai泵，SPDM10AVP检测器，CTO10A柱温箱，Classvp 工作站）。
       1.2  试剂和样品甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。黄芩苷对照品购自中国药品生物制品检定所，清开灵注射液、清开灵胶囊、清开灵颗粒、清开灵口服液均为市售产品。
       　　2  方法与结果
       2.1  样品的制备取清开灵注射液适量，用50%甲醇稀释，通过0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；取清开灵口服液适量，用50%甲醇稀释，通过0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；取清开灵颗粒适量，50%甲醇溶解，超声10 min ,9000 r/min高速离心5 min,取上层清液通过0.45μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；取适量清开灵胶囊，剥开囊壳，颗粒用50%甲醇溶解，超声10 min,9000 r/min高速离心5 min,取上层清液通过0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液；取黄芩苷对照品适量，加50%甲醇溶解，制成含黄芩苷100 μg/ml的溶液，作为对照品溶液。
       2.2   色谱条件及分析方法色谱柱为NUDEOSILC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为（A）甲醇（B）0.5%醋酸，梯度洗脱：0 min：10%甲醇，50 min：100%甲醇，65 min：100%甲醇；检测波长255 nm；流速1.0 ml・min-1；柱温40℃，进样量20 μl。
       2.3  方法学考察
       2.3.1   精密度实验取同一批号供试品溶液，连续进样6次。结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于95% ，符合指纹图谱研究技术的要求。
       2.3.2   稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，12，24 h检测。结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于95%，符合指纹图谱研究技术的要求。
       2.3.3   重复性实验取同一批号供试品6份，制备供试品溶液，分别进样检测。结果表明，指纹图谱中各共有峰相对保留时间和峰面积基本一致，其相似度均大于95%，符合指纹图谱研究技术的要求。
       2.4  样品测定分别取清开灵胶囊、清开灵颗粒、清开灵口服液、清开灵注射液各4批，按供试品的制备方法制备供试液并检测，用中药指纹图谱相似度计算软件进行了分析，以黄芩苷的色谱峰为参照物峰，其相对保留时间为41.9 min, 标示了清开灵不同制剂的色谱峰，见图1（S1S4为清开灵口服液，S5S8为清开灵颗粒剂，S9S12为清开灵胶囊，S13S16为清开灵注射液），相对保留时间和相对峰面积结果见表1。
       2.5  结果利用中药指纹图谱相似度计算软件，以1批清开灵注射液图谱作为对照模板，计算16批样品的相似度，结果清开灵注射液与清开灵口服液相似度均在0.90以上，而清开灵胶囊与清开灵颗粒相似度均在0.4以下，可能是因为生产工艺的不同引起不同制剂的成分和含量有较大差异。根据16批不同制剂指纹图谱的检测结果，总结出典型的色谱峰共16个，其中峰9为黄芩苷的色谱峰；7号峰为颗粒剂的特有峰，但5，6号峰缺失；注射剂中色谱峰最多，而胶囊剂只有少数几个特征峰；14，15号峰为口服液的特有峰，但峰形较宽，或见肩峰。
       表 1  清开灵不同制剂指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积（略）
       图  1   清开灵不同制剂指纹图谱（略）
       图 2   清开灵不同制剂样本相似度比较（略）
       　　3  讨论［2,3］
       3.1  色谱条件的选择
       3.1.1  色谱柱的选择本实验比较了3个不同厂家的色谱柱，NUDEOSILC18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）,PHENOMENEXC18 柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm），SINOCHROM ODS(200 mm×4.6 mm, 5 μm)，SINOCHROM ODS色谱柱的柱效较差，大多数峰不能分开，NUDEOSILC18柱和PHENOMENEXC18 柱的分离情况相近，综合考虑，选用NUDEOSILC18柱作为本实验的色谱柱。
       3.1.2  流动相的选择本实验先采用了等度洗脱，发现用强洗脱能力的流动相时，出峰时间很早，且峰不能很好的分开，再用弱洗脱能力的流动相时，出峰少，且出峰时间太迟；故采用梯度洗脱，分别使用了乙腈-水，乙腈0.5%磷酸，乙腈0.5%醋酸，甲醇水，甲醇0.5%磷酸，甲醇0.5%醋酸作用流动相进行线性梯度洗脱，发现用洗脱能力较弱的甲醇时峰的分离情况较乙腈好，在水相中加入磷酸或醋酸后，出峰明显增多，峰形有较大的改善，而用醋酸时的基线较磷酸时平直，综合考虑，选用甲醇0.5%醋酸线性梯度作为本实验的流动相。
       3.1.3  检测波长的选择本实验设定检测器从200～360 nm波长范围内进行测定，在低波段230 nm以下时，色谱图的基线有较明显的飘移，而270 nm以上时色谱峰明显的减少，故本实验选用了255nm作为指纹图谱的检测波长。
       3.1.4  柱温的选择实验发现柱温在30℃以下时，内标物黄芩苷色谱峰与后面成分峰重叠，且45 min的3个峰无法分离；故本实验选择柱温为40℃，使上述问题得以改善。
       3.2  提取溶剂的筛选在提取溶剂的筛选中，采用了30％，50％，70％甲醇作提取溶剂，进样后发现30%甲醇提取物的图谱中峰1、峰3分裂的峰严重重叠，难以分辨,且出峰数目比50％甲醇提取物的图谱明显要少；而70%甲醇提取物的图谱中，30 min以前的特征峰较50％甲醇提取物的图谱有所减少，且出峰时间很慢，综合考虑，用50％甲醇作提取溶剂。
       3.3   统计方法用指纹图谱相似度计算软件判断具有客观性，减少人为误差，也减少了按以前指纹图谱统计方法来统计的工作量，值得推广。
       　　参考文献：
       ［1］   国家药品监督管理局.关于印发《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》的通知［J］.中成药，2000，22（10）：671.
       ［2］  屠鹏飞.高效液相法制定中药材和中药注射剂特征指纹图谱的探讨［J］.中成药，2000，22（7）：516.
       ［3］  倪力军，张立车，李  鹏.对中药指纹图谱研究现状及应用的思考［J］.天然产物研究与开发，2002, 14（5）：60.
       (中南大学湘雅二医院，湖南 长沙  410011；  中国药科大学国家新药筛选中心，江苏 南京  210038;中南大学湘雅二医院临床药学研究室，湖南 长沙  410011)