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       【关键词】  参芪补血颗粒；,,正交实验；,,高效液相色谱法；,,黄芪甲苷
       摘要：目的研究参芪补血颗粒剂的最佳提取工艺。方法选用L9（34）正交表设计实验，并以黄芪甲苷(C41H68O14)和干膏得率作为考察指标，考察乙醇浓度、乙醇用量、提取次数、提取时间对提取效果的影响。结果参芪补血颗粒的最佳提取工艺为用65%的乙醇8倍量，回流提取3次，1.5 h/次。结论 采取正交设计筛选出最佳提取方法较好，操作简单，重现性好，有效成分提取率高，工艺可行。
       关键词：参芪补血颗粒；  正交实验；  高效液相色谱法；  黄芪甲苷 
       A study on Optimum Preparation Process of shenqibuxue granules by Orthogonal Experiment
       LI Xiaoye,LIU Wenxing,MI Cunyun，PEI Junping，QIN Xiangyang
       (The Fourth Military Medical University，Shanxi, Xi"an 710032，China)
       Abstract：ObjectiveTo develop the optimal extractive techniques of Shenqibuxue Granules. MethodsL9（34）orthogonal experiment was applied to new developments in extractive techniques. The yield of astragaloside (C41H68O14) and dry extract conditioned extracting crude drugs from alcohol. Moneover, in the light of content indexes, four factors must be taken into consideration: the frequency and time of extracting, the quantity and concentration of alcohol. ResultsThe optimal extractive techniques were then advanced. 8 folds of 65% alcohol were refluxed for 3 times, each time for 1.5 h.ConclusionThe proposed methods result in good reproducibility as well as high yield of active constituents. Thus, it is feasible to follow the optimal extractive techniques.
       Key words：Shenqibuxue Granules;   Orthogonal experiment;  HPLC;   Astragaloside
   
　　参芪补血颗粒是由黄芪、当归、制首乌、党参等6味中药组成的中药复方制剂。主要用于治疗贫血和放射、化疗时引起的白细胞、血小板减少等血虚症。黄芪系方中君药，黄芪甲苷为其活性成分之一，对药物和放射所致白细胞和淋巴细胞降低具有明显的改善作用［1］，并且其稳定性好。因此，测定提取液中黄芪甲苷的含量可作为评价本制剂质量的客观指标之一，浸膏提取量也可作为有效成分提取率的指标。故为了发挥药物的最佳疗效，优化制备工艺，本文以黄芪甲苷含量为指标、结合浸膏得率，用正交实验法优选本制剂的最佳提取工艺，为工业化生产提供依据。 
       1  仪器与试剂 
       DIONEX Summit 680高效液相色谱仪(美国)：DIONEX P680 HPLC PUMP，Thermostatted Column Compartmemt TCC-100，Alltech 2000ES型ELSD、DIONEX Chromenleon Chromatography Management System； SK250LH型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；ZORBAX ExtendC18（4.6 mm×150 mm，5μm 美国安捷伦科技有限公司） 色谱柱。 黄芪甲苷对照品（0781200311）中国药品生物制品检定所；参芪补血颗粒由第四军医大学药物研究所和化学教研室研制；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
       　2  方法与结果
       2.1  高效液相色谱方法的建立
       2.1.1   色谱条件流动相乙腈水（32∶68）；流速：1.0 ml・min-1；柱温：25 ℃；Alltech 2000ES型ELSD；飘移管温度：100.6 ℃；气体流速：2.7 L・min-1；进样量：20 μl；理论塔板数以黄芪甲苷峰计算大于5 000。色谱图见图1。
       a-对照品    b-供试品
       图1  色谱图（略）
       2.1.2   标准曲线的制备 精密称取黄芪甲苷对照品12.5 mg置于25 ml容量瓶中，加入无水甲醇定容至25 ml，配制为0.5 mg・ml-1的黄芪甲苷对照品储备溶液。用移液管分别精密移取1.0，2.0 ，3.0 ，4.0，5.0，6.0 ml黄芪甲苷对照品储备溶液置10 ml容量瓶中，加甲醇定容，分别得到浓度为0.05，0.10，0.15，0.20，0.25,0.30 mg・ml-1的标准品溶液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，进样20 μl在给定色谱条件下进行测定。以进样量的常用对数值（x）为横坐标，蒸发光峰面积的常用对数值（y）为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：y = 0.957+1.635x，r= 0.999 2，黄芪甲苷在1.0 ~ 6.0 μg的范围内呈良好的线性关系。
       2.2  提取方法的选择
       2.2.1  醇提正交实验 根据文献研究及预实验，设计提取工艺的正交实验因素水平，结果见表1。
       表1  因素水平表（略）
       根据因素水平表，选用L9（34）正交实验表进行实验（见表2）。每份称取参芪补血颗粒原药材36 g，按正交表实验方案进行提取，提取液减压浓缩并用双蒸水定容到200 ml的容量瓶中，超声溶解，以供测定两个检测指标的含量。
       2.2.2   提取液中黄芪甲苷和干浸膏得率的测定提取液中黄芪：甲苷含量测定用移液管精密移取2.2.1项下定容到200 ml的提取液50 ml到250 ml圆底烧瓶中，于旋转蒸发仪上旋转蒸干，残渣加水20 ml超声溶解后，转移至分液漏斗，以水饱和的正丁醇萃取4次，30 ml/次，合并正丁醇萃取液，用氨试液（40 ml浓氨水加水配成100 ml）充分洗涤2次，30 ml/次，弃去氨液，将正丁醇层在旋转蒸发仪上减压回收至干，用甲醇超声溶解并定容至10 ml，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，得供试品溶液［2］。在选定的色谱条件下测定，进样量20 μl，记录色谱峰面积，根据回归方程计算提取液中黄芪甲苷的含量，结果见表2。干浸膏得率测定：用移液管精密移取2.2.1项下定容到200 ml的提取液50 ml置于已干燥至恒重的蒸发皿中，先于水浴上挥干，然后按2005年版中国药典一部附录Ⅸ H烘干法进行测定，即将盛有样品溶液的蒸发皿置于烘箱中，在100 ~ 105℃下干燥5 h，然后移置于干燥器中冷却30 min，精密称定重量，再在上述温度干燥1 h，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据所得的干膏重量计算药材干浸膏的得率。结果见表2。
       表2   正交实验黄芪甲苷得率测定结果（略）
       2.3   提取工艺的优化利用直观分析和方差分析对表2中的试验结果进行数据分析，直观分析结果见表2，方差分析结果见表3~4。通过黄芪甲苷含量、干膏率双指标进行考察，两者在醇的用量上存在差异，但通过方差分析可以看出醇的用量对黄芪甲苷含量、干膏率两者的测定结果并无显著性影响，故从节约成本的角度考虑，优选出最佳工艺为A1B2C3D2，即用65%的乙醇8倍量，回流提取3次，1.5 h/次，所得样品上述成分提取率最高。
       2.4  最佳工艺验证为验证所优选工艺的可靠性和重复性，我们按最佳工艺平行制备3份样品，测定黄芪甲苷得率平均为0.107%，干膏平均得率为42.76%，均高于正交9份样品的得率，说明本工艺结果可靠，适用于工业生产。
       表3   正交实验黄芪甲苷含量方差分析（略）
       表4   正交实验干膏得率方差分析（略）
       　3  讨论
       黄芪系方中君药，在造血功能方面的作用包括：小鼠灌服膜荚黄芪煎煮剂，对失血性贫血以及环磷酰胺所致白细胞和血小板的减少均有促进恢复作用［3］，对环磷酰胺（CTX）所致小鼠造血功能损伤，灌服黄芪煎剂可使增加骨髓造血干细胞和粒单系造血祖细胞集落数显著增加［4］等。而黄芪甲苷是黄芪中的主要有效成分，并且其稳定性较好。因此,本试验以黄芪甲苷含量测定作为评价有效成分提取率的客观指标之一。由于黄芪甲苷仅在200 nm左右有弱的末端吸收，如用紫外检测法进行含量的测定，则存在着噪音对结果影响较大，灵敏度较低的缺陷。作者曾用甲醇代替乙腈进行实验，发现黄芪甲苷易受到试剂的干扰，因此，本文采用ELSD测定黄芪甲苷的含量。ELSD是一种新型的检测器，适用于不挥发或半挥发样品的检测，而不受被测组分在相同条件下无其色谱峰的出现及化学结构的影响，具有灵敏度高、重现性好的优点。
       　参考文献：
       ［1］  张银娣，徐勤娥，刘小浩，等.黄芪苷升高白细胞及抗应激作用的研究［J］.南京医学院学报，1992，12（3）：244.
       ［2］  赵灵芝，朱丹妮，严永清．HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量［J］.药物分析杂志，1999，19(6)：403.
       ［3］  李仪奎，徐  军，张晓晨，等．黄芪当归对配伍的药理作用研究［J］.中药药理与临床，1992，8(2)：1.
       ［4］  全宏勋．黄芪水煎液对环磷酰胺抗肿瘤活性与毒性的影响［J］.中药材，1995，18(7)：356.
       （中国人民解放军第四军医大学，陕西 西安  710032）