文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的测定并比较不同生长期山楂叶中黄酮类化合物含量的差异。方法采用分光光度法和高效液相色谱法检测黄酮类化合物的含量。结果在不同的生长期，山楂叶中总黄酮和牡荆素鼠李糖苷的含量都在8月份最高,然后逐渐降低。结论 以提取黄酮类化合物为目的的山楂叶最适宜在8月份采收。
       【关键词】  山楂叶；黄酮类化合物；高效液相色谱法； 超高压提取
       
       Content Determination of Flavonoids from Hawthorn Leaves at Different Growth Time
       LI Hongwei,  ZHANG Shouqin，DOU Jianpeng,  XI Yushi
       1.College of Biological and Agricultural Engineering, Jilin University, Changchun 130022, China；
       2.Jilin Provincial Economic Management Cadre College, China
       Abstract：ObjectiveTo compare the contents of flavonoids in Hawthorn leaves of different growth stages. MethodsThe contents of flavonoids were determined by UVspectrophotometry and HPLC. ResultsAt different growth stages, the contents of total flavonoids and 2ORhamnosylvitexin were the highest in August; afterwards, the content of flavonoids decreased. ConclusionAugust was appropriate time in order to obtain flavonoids components from Hawthorn leaves.
       Key words：Hawthorn leaves;   Flavonoids;   HPLC;   High hydrostatic pressure extraction
        山楂叶为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge.Var.Major N.E.Br. 或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥叶，山楂叶中所含的黄酮类成分具有降压、强心等多种药理活性，尤其对缺血性心肌损伤有明显的保护作用［1，2］。为了更合理地综合开发利用山楂叶和确定最佳采收期，本文对不同生长期的山楂叶中的总黄酮和牡荆素鼠李糖苷分别进行了含量比较分析。对山楂叶中黄酮类成分进行提取，常用的方法主要有乙醇回流法［3，4］和酶法［5，6］。这些方法存在提取时间长、提取液中杂质多(如无机盐、蛋白质、糖等)、分离困难、能耗高、热敏性化合物易发生变性等不足。而超高压提取技术［7，8］是一种新兴的天然药物有效成分提取技术，它是利用100 mPa以上的流体静压力作用于料液上，经过短时间提取后迅速卸压，然后再进行分离纯化的一种提取技术。本实验将超高压提取技术应用于山楂叶黄酮提取，大大缩短了样品的制备时间。
       1 仪器与材料 
        
        DL700超高压等静压机（上海大隆机器厂），日本岛津LC20A高效液相色谱仪，UV-2450紫外可见分光光度计，MV110电子天平（上海天平仪器厂）。
        山楂叶采于吉林省吉林市昌邑区土城子乡，经鉴别为Crataegus pinnatifida Bge. var. Major N.E.Br；牡荆素鼠李糖苷（MP biomedicals）；芦丁对照品（中国药品与生物制品检定所）；冰醋酸为色谱纯；乙醇为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  总黄酮含量测定
       2.1.1  对照品溶液的制备精密称取在干燥至恒重的芦丁对照品10 mg，用50%乙醇定容至50 ml容量瓶中，即得对照品溶液。
       2.1.2  标准曲线的制备精密量取对照品溶液1，2，3，4 ，5，6 ml，分别置25 ml量瓶中，各加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 ml，再加水至刻度， 摇匀， 放置15 min， 以相应试剂为空白， 立即用分光光度法，在500nm的波长处测吸光度(A)，以吸光度为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：C=0.077A，r=0.999 8。
       2.1.3  供试品溶液的制备精密称取山木楂叶粉末0.5 g，准确加入50%乙醇25 ml，混匀，压力为400 mPa，提取时间为3 min，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
       2.1.4  样品测定精密量取上述待测液1 ml于25 ml容量瓶中，加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，摇匀，放置6 min， 加10%硝酸铝溶液1 ml，摇匀，放置6 min，加4%氢氧化钠溶液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，立即按照紫外－可见分光光度法，在500 nm的波长处测吸光度值（A），按照回归方程计算含量。结果见表1。表1  样品中总黄酮测定结果（略）
       2.2  牡荆素鼠李糖苷的含量测定
       2.2.1 色谱条件RP-C18色谱柱250 mm × 4.6 mm（5 μm）；流动相以A：乙腈，B：0.5%乙酸水溶液梯度洗脱，起始时，A：20%，20 min，A：20%，20.01 min，A：28%，40 min，A：40%；检测波长为340 nm；流速0.8 ml/min。
       2.2.2  对照品溶液的制备 精密称取在干燥至恒重的牡荆素鼠李糖苷对照品3.0 mg，用50%乙醇定容至10 ml容量瓶中，即得对照品溶液。
       2.2.3  线性关系考察精密吸取牡荆素鼠李糖对照品溶液2，4，6，8，10 μl进样，绘制标准曲线，回归方程为Y= 9×10-7X - 0.057 9，r=0.999 5，牡荆素鼠李糖苷在0.5 ～ 2.5 μg具有良好线性关系。
       2.2.4  供试品溶液的制备精密吸取牡荆素鼠李糖对照品溶液2，4，6，8，10 μl进样，绘制标准曲线，回归方程为Y= 9×10-7X - 0.057 9，r=0.999 5，牡荆素鼠李糖苷在0.5 ～ 2.5 μg具有良好线性关系。
       2.2.5  精密度实验精密吸取对照品溶液，重复进样5次，测定结果为RSD=1.58% ( n=5)。
       2.2.6  稳定性实验取一种供试品溶液，每隔2 h进样10 μl，测定结果为RSD=1.17% ( n=5)。
       2.2.7  重复性实验 取同一批号样品5份，按供试品溶液制备方法平行处理，依法测定，测定结果为RSD=2.01% 。
       2.2.8  回收率实验精密称取已知含量的样品数份，精密加入一定量的牡荆素鼠李糖苷对照品，按照含量测定方法进行测定，计算回收率为99.17% ，RSD=1.32% ( n=5)。
       2.2.9  样品含量测定分别取不同生长期的的样品按供试品溶液制备方法处理，依法测定，计算含量。结果见图1及表2。表2  样品中牡荆素鼠李糖苷测定结果（略）
       3  讨论
        对山楂叶中的黄酮类化合物进行HPLC分析，多以金丝桃苷［9,10］和以牡荆素［11］为标准品，但牡荆素鼠李糖苷为山楂的专属性成分［12］，因此本实验以牡荆素鼠李糖苷为标准品进行了山楂叶中黄酮类化合物的HPLC分析。在实验过程中，发现此流动相体系的选择比较困难，经过反复摸索，选择了前文的流动相配比，分离效果较好，在此条件下牡荆素鼠李糖苷与山楂中其它成分达到较好的分离。    在提取山楂叶中的黄酮类有效成分时，比较了传统工艺和超高压提取工艺，超高压提取方法的优点是提取速度快、杂质少、收率高，因此采用了超高压提取技术进行了黄酮类化合物的提取，然后采用HPLC进行检测，大大缩短了样品的分析测试时间。
        实验结果表明，山楂叶中的总黄酮和牡荆素鼠李糖苷的含量（表1～2），既不是花期最高［10］，也不是秋季摘果后最高［9］。而是从花期（5月下旬）开始，逐渐增高，到8月份达到最高，然后随着果实的成熟，含量逐渐下降，到落叶时（10月下旬）含量最低。因此，如果以提取山楂叶中的黄酮类化合物为目的，应该选择8月初的山楂叶，此时的总黄酮和牡荆素鼠李糖苷含量都是最高，为合理的采收和利用提供了理论依据。为充分利用有限的中药资源，应该选择最佳的采收期，从而提高中药的利用价值。
        
       【参考文献】
         　　［1］Yan B. Effect of total flavones of Crataegus on expression of Hsp70 ［J］.China and foreign Medical Journal (中华中医学杂志)，2005，3(7)：7.
       
       ［2］Ye X Y, Zhang L, Zhang J, et al. Effect of hawthorn leaves flavonoids on cultured myocardial cell injury by hypoxia-no glucose［J］.Chin JMAP (中国现代应用药学杂志)，2005，22(3)：202.
       
       ［3］Wang W, Zhou Z H, Cui Y, et al. Studies on the method of flavones extraction from Chinese Hawthorn leaf and analysis of the basic structure ［J］.China Food Addictives (中国食品添加剂)，2000，(4)：7.
       
       ［4］Zhang S R, Wang L J, Liu S X, et al. The optimum extraction conditions of flavonoids in Hawthorn leaves［J］.J NE For Univ (东北林业大学学报)，2001，29(4)：71
       
       ［5］Chen B H, Zhang Q Q, Xie B, et al. A study of the influence of enzymolysis over the extraction and content analysis of flavones in Crataegus pinnalifida ［J］.J Fujian Tchr Univ (福建师范大学学报)，1997，13(4)：90.
       
       ［6］Wang X, Li L B, Ma X L, et al. Studies on total flavone from Cratacgus pinnatifida Bge leaves by enzymatic extraction［J］.Sci and Technol of Food Indus (食品工业科技)，2002，23(3)：37.
       
       ［7］Zhang Shouqin, Zhu Junjie, Wang Changzheng. Novel high pressure extraction technology ［J］.Int J Pharm 2004，278：471.
       
       ［8］Zhang Shouqin, Xi Jun, Wang Changzheng. High hydrostatic pressure extraction of falvonoids from propolis［J］.J Chem Technol Biotechnol 2005，80：50.
       
       ［9］Li B, Zhang K, Cao W D, et al. Determination of hyperoside in hawthorn leaves byHPLC［J］.Chinese Pharmaceuticals (中国药业)，2003，12(12)：37.
       
       ［10］Shi R P, Zhou Q Y, Chen X J, et al. Content determination of flavonoids components from Hawthorn Leaves at different growth time［J］.Chinese Pharmaceuticals (中国药业)，2002，11(7)：55.
       
       ［11］Zhong Y, Yang S J, Wang J, et al. Determination of Vitexin in leaf of Crataegus pinnatifida Bge. by HPLC ［J］. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research (时珍国医国药)，2000，11(10)：871.
       
       ［12］Sun J Y, Yang S B, Li G H. Investigation on method speciality in identifying Fructus Crataegi with vitexin rhamnoside［J］.Zhong Yao Cai (中药材)，2001，24(12)：859.