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       【摘要】 
       目的为开发利用平白术的药用价值提供理论依据，分别提取分离平白术中有效成分多糖和氨基酸，并分别测定平白术多糖和氨基酸的含量。方法采用L9（34）实验因素设计实验，苯酚-硫酸法测定白术多糖的含量。以茚三酮为衍生试剂，采用柱后衍生法测定平白术中氨基酸含量。 结果平白术多糖的含量为15.3% 。平白术中至少含有17种氨基酸，总氨基酸含量为73.73 mg·g-1。结论 方法简单、有效、快速、准确、灵敏，适合于分析测定白术中多糖和氨基酸的含量。
       【关键词】  平白术；多糖；氨基酸
       
       Study on Extraction and Determination of the Contents of Polysaccharide and Amino Acid in Atractylodes macrocephala Koidz
       CHEN Wen，LI Li-li，ZHANG Ping，JIANG Manhua, QIU Ximin1
       1.Department of Pharmacy, Medical College of Hunan Normal University, Changsha  410006，China；
       2. Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences， Changsha 410000，China
       Abstract:ObjectiveTo extract polysaccharide and amino acid　and determine their contents in order to offer the basis for using Atractylodes macrocephala Koidz from Pingjiang. MethodsUsing L9（34）orthogonal test，Phenolsulfuric method was used to test polysaccharide content in Atractylodes macrocephala and to assay amino acid using method of Ninhydrin post-column derivation .ResultsThe analysis of Atractylodes macrocephala Koidz showed that the content of polysaccharide was 15.3% and there were at least 17 kinds of amino acids，the total content was 73.73 mg·g-1.ConclusionThe established method is quite suitable for identification and quantification of polysaccharide and amino acids in Atractylodes macrocephala Koidz.It is simple，effective，rapid，accurate and sensitive.
       Key words:Atractylodes macrocephala Koidz  ；  Polysaccharide;   Amino acid
        白术是传统中药，《中国药典》收载的白术为菊科植物Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根茎，白术具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎之效［1］。《中国药典》2005年版第一部记载含白术的处方有91个。近几年以来，中国对白术的需求量大增，居全国大宗常用中药材之首。由于其含有白术多糖、挥发油、氨基酸等多种有效成分而倍受药物研究工作者的关注，使白术的临床应用日趋广泛［2］，其研究也更为深入、更为多元化。然而，迄今为止，对白术中营养成分氨基酸研究甚少。为了开发利用白术的药用价值，本文对湖南平江产白术——平白术进行研究，提取平白术多糖、氨基酸，采用正交实验选择多糖显色条件，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。以茚三酮作衍生试剂，采用柱后衍生法测定氨基酸含量。
       1  材料
       1.1  仪器
       UV2150型分光广度计（日本岛津），日立L8800全自动氨基酸自动分析仪
       1.2  试剂无水乙醇、硫酸锌、氢氧化钡、硫酸、苯酚、茚三酮、柠檬酸。三钠、醋酸钠（均为分析纯）,平江白术（由湖南药材公司提供）、果糖标准品（市售）、氨基酸标准品（中国科学院亚热带农业生态研究所提供）。
       2  方法与结果
       2.1  显色条件的考察
       2.1.1  苯酚浓度对显色单因素的影响吸取标准溶液1 ml于10 ml具塞试管中，精密加入1 ml不同浓度的苯酚和5 ml浓硫酸，混匀，放置5 min。移入25℃的水浴中保温20 min。冷却。以蒸馏水1 ml加相应的试剂作空白，测定吸收度。见图1，表1。表1  苯酚浓度的考察（略）
        实验结果表明,苯酚浓度在4%～7%范围内所得吸收值相近,苯酚浓度为5%时所得吸收值较大,故选择苯酚浓度为5%。
       2.1.2  苯酚-硫酸法正交实验设计［3］实验因素水平表设计：实验选择苯酚用量（5%苯酚）、浓硫酸用量、水浴温度和水浴中的放置时间4个因素作为考察对象，根据初步实验，每个因素确定3个水平，采用L9（34）正交表进行实验（见表2）。以吸收度为评价指标（表3）。对结果进行统计学处理，得方差分析见表4。表2  实验因素水平（略）表3  L9（34）正交实验结果（略）表4  方差分析（略）
        经方差分析可知，苯酚用量、浓硫酸用量、水浴温度及水浴放置时间对吸收度影响不显著，但综合比较，本实验选择苯酚-硫酸法最佳显色条件为A3B1C3D2即苯酚1.2 ml，浓硫酸4 ml，水浴温度25℃，水浴放置时间30 min。
       2.2  测定波长的选择精密称取一定量多糖样品置小烧杯中，加水溶解，定量转移至100 ml量瓶中，加水至刻度，混匀。吸取该样品2 ml于试管中，加5%苯酚水溶液1.2 ml混匀，迅速加入4 ml浓硫酸，振摇10 min，在25℃水浴保温放置 30 min，取出冷却，以苯酚-硫酸溶液为空白，于400～800 nm范围扫描，选择最大吸收波长488.4 nm为测定波长。
       2.3  标准曲线精密称取105℃干燥至恒重的标准果糖18.70 mg，加水溶解至250 ml，配成74.8 μg/ml的标准储备液。取10 ml具塞试管，分别加上述标准液0.0，0.10，0.20 ，0.30，0.40 ，0.50，0.60，0.70 ml，加水稀释至1 ml，摇匀，每个试管各加5%苯酚水溶液1.2 ml混匀，再迅速加入4 ml浓硫酸，振摇10 min，在25℃水浴保温放置 30 min 。以水作空白在488.4 nm处测定各标准液的吸收度，得回归方程A=0.098 3C+0.0.092 6（r=0.999 4）。其在1～20.6 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系。
       2.4  换算因素测定精密称取干燥的平白术多糖20 mg，用蒸馏水溶解后定容至100 ml，作为多糖储备液。精确量取多糖储备液0.2 ml，加水至1.0 ml，按测定标准曲线同样的方法测其吸光度值。按下式计算换算因素：f=W/CD，试中：W为多糖质量（μg），C为多糖液中果糖的浓度（μg/ml），D为多糖的稀释因素，测得f=1.24。
       2.5  平白术多糖、氨基酸的提取
       2.5.1  平白术多糖的提取［4］精密称取白术粗粉50 g置于1 000 ml的容量瓶中，加6倍量70%的乙醇回流2 h。过滤，取滤渣加8倍蒸馏水回流2 h，趁热过滤。在滤渣中加6倍水回流1 h，趁热过滤。再在滤渣中加3倍量水回流1 h，趁热过滤，合并3次滤液，浓缩至100 ml，加无水乙醇至乙醇浓度达85%，再用75%乙醇冲洗，离心，反复6次，去溶液取沉淀。加水溶解，用5% ZnSO4 4 ml和饱和Ba（OH）2溶液16 ml振摇，离心去蛋白，反复10次［5］。将所得溶液置于冰箱中过夜，次日取出溶解，在8 000 r/min离心15   min，反复4次。用氯仿-正丁醇（4∶1）与溶液按5∶1的比例混合搅拌15 min，离心，反复3次，得澄清液即白术多糖溶液。加水至100 ml冷藏备用。
       2.5.2  平白术氨基酸的提取称取平白术粉末40 g（过80目）投入装有搅拌器、温度计、回流冷凝器的三颈烧瓶中，加入6 mol/L的盐酸100 ml，加热水解24 h，反应温度保持在(110±1)℃左右。滤渣用少量稀盐酸浸泡，过滤，重复两次，收集3次滤液得水解液，加热7h赶盐酸。在滤液中加入0.5 g活性碳且维持滤液在(80～90) ℃，磁力搅拌脱色30 min，重复2次，减压浓缩得到50 ml橙红色的溶液，作为储备液。于4℃的冰箱中保存。
       2.6  平白术多糖和氨基酸含量的测定
       2.6.1  样品多糖含量的测定平白术多糖提取液稀释至适当倍数后，精密吸取1.0 ml，按照标准曲线的方法测定吸光度，计算平白术多糖的含量。
         按下式计算多糖含量：多糖含量=CDfW×100%，式中：
        W为多糖质量（μg），C为多糖液中果糖的浓度（μg/ml），D为多糖的稀释因素，f为换算因素。测得多糖的含量为15.3%。
       2.6.2  回收率实验在样品液中精密加入不同浓度的果糖标准液（n=5），按2.3项下操作，并适当稀释，以样品液为空白，测定吸收度，计算回收率。平均回收率为98.5%，RSD=2.1%（n=5）。结果如表5。表5  回收率实验结果（略）
       2.6.3   稳定性实验取样品在8 h内测定吸收度，1次/h。样品在4 h内稳定，RSD=1.2% 。
       2.6.4   平白术氨基酸的测定条件［6］
        实验条件：L-8800型全自动氨基酸分析仪，钠型阳离子交换柱（4.6 mm×60 mm），分析时间35 min，流动相柠檬酸三钠缓冲液（pH 3.2～4.9），四元梯度洗脱 ， 缓冲液流速0.4 ml/min，茚三酮流速0.35 ml/min，缓冲液泵压力8～11.5 Pa，茚三酮泵压力0.9～1.2 kPa，柱温50℃，氮气压力20 kPa。
        柱的衍生条件：反应液A：390 g茚三酮/L丙二醇甲醚，反应液B：醋酸钠/醋酸：丙二醇甲醚（60∶40）；供试品和对照品溶液进样量均为20 μl。
       2.6.5   平白术氨基酸含量的测定按上述色谱条件，使用日立L-8800 AAA分析仪进行样品测定。分离得到的氨基酸谱图如图2～3。样品中氨基酸的含量结果见表6。表6  平白术中氨基酸含量测定结果（略）
       3  讨论
       3.1  本实验采用75%乙醇提取除去平白术所含单糖、低聚糖等干扰性成分后，再用水提醇沉法制得白术多糖。在采用Sevag法去蛋白至少重复6～7次，才能基本上除去蛋白，且多糖损失率也较大。本实验采用硫酸锌与饱和氢氧化钡溶液脱蛋白后，再加冷冻-Sevag法除蛋白，去蛋白比较彻底。在进行乙醇沉淀时，85%的乙醇浓度已能将多糖基本沉淀出来，增加乙醇浓度对多糖的得率影响并不显著。多糖采用真空干燥法，可避免加热干燥而出现多糖变黏稠或碳化而结块现象。
       3.2  氨基酸是构成生物体蛋白质分子的基本单位 ，与生物的生命活动密切相关，尤其与人类健康有着紧密的关系。本分析结果表明，平白术氨基酸至少含有17种氨基酸，总含量为73.73 mg·g-1。必需氨基酸和半必需氨基酸在人体中具有重要的作用，缺一不可，否则可引起生理功能异常，导致疾病。总氨基酸中含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸等7种人体必需氨基酸，并含胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸等4种半必需氨基酸。必需氨基酸和半必需氨基酸在总氨基酸中分别占12.7%，17.8%。在水解氨基酸时，温度应严格控制在（110±1）℃，水解24 h，才能使蛋白质完全水解。
       3.3  本研究为白术中有效成分多糖及氨基酸的提取分析、质量评价提供了一个新的定量标准，为开发利用平江白术提供了理论依据。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：77.
       
       ［2］刘思贞，邵玉芹，祝希娴.白术药理研究进展［J］.时珍国医国药，1999，10（8）：634.
       
       ［3］张维杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海：上海科学出版社，1987：6.
       
       ［4］张立，马琼，何永利，等.灵芝、香菇、黄芪、枸杞提取物中多糖的含量测定［J］.中草药，2004，35（2）：167.
       
       ［5］陈柳蓉，邵 青，陆 蕴.白术及炮制品的多糖含量测定［J］.中草药，1997，28（4）：214.
       
       ［6］杨文军，李德发，王若军，等.离子交换色谱OPA柱后衍生法测定饲料中胱氨酸和蛋氨酸的含量［J］.中国畜牧杂志，2000，36（1）：26.