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       【摘要】 
       目的研究不同提取方法对虎杖蒽醌类成分及其抗氧化作用的影响。方法采用回流、索氏、微波及超声四种提取方法，测定四种提取液中的游离蒽醌和总蒽醌的含量；采用DPPH，FRAP两种方法测定其抗氧化活性，并分析蒽醌类成分和抗氧化活性之间的关系。结果在对游离蒽醌的测定中以索氏法为最高（0.53%），其次为超声（0.45%），各种方法之间相比差异显著（P＜0.05）；在对总蒽醌的测定中，结果如下：索氏（1.16%）＞超声（1.15%）＞微波（1.04%）＞回流（0.80%）；抗氧化活性测定发现，以回流液的抗氧化能力最强，其次是微波，二者与超声和索氏的相比有显著性差异（P＜0.05）；相关性分析发现，蒽醌的含量与抗氧化活性呈显著的负相关(P＜0.01)。结论不同提取方法影响虎杖蒽醌类成分和抗氧化活性，蒽醌类成分和抗氧化活性之间具有负相关的关系。
       【关键词】  提取方法； 虎杖； 蒽醌； 分光光度法； 抗氧化
       
       Effect of Different Extraction Methods on the Content of Anthroquinone  Compound and its Antioxidative Activity in Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.
       LIU Jianhua，HAN Liqiang,ZHAO Hanyu,MO Juan,ZHANG Sumei, PAN Yushan
       1.Engineering College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002 ,China；
       2.Mechanical and Electrical Engineering College, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002 ,China
       Abstract:ObjectiveTo explore the effect of different extraction methods on the content of anthroquinone  compound and its antioxidative activity in Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc..MethodsAnthroquinone  compound  was extracted respectively by reflux method, Soxhlet extraction method ultrasound wave method and microwave-assisted extraction. The free and total anthroquinone content and its antioxidative activity was determined by spectrophotometry. The correlation between anthroquinone  compound and antioxidative activity was analyzed.ResultsThere were significant differences in the extraction content of free anthroquinone content among the  four extraction method stated（P＜0.05）,Soxhlet extraction method was the highest（0.53%），ultrasound wave method  was better（0.45%）. In the determination of total anthroquinone, the result was:Soxhlet extraction method（1.16%）> ultrasound wave method（1.15%）microwave-assisted>reflux method > extraction. The reflux method was better than microwave-assisted extraction, compared with Soxhlet extraction method  and ultrasound wave method. There were significant differences in the determination of its antioxidant activity（P＜0.05）． There was significant negative  correlation   between anthroquinone  compound and its antioxidative activity (P＜0.01) .ConclusionAnthroquinone  compound and antioxidative activity in Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc. was affected by different extracting methods, there was negative  correlation  between anthroquinone  compound and antioxidative activity.
       Key words:Extraction method;  Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.;  Athroquinone  compound;    Spectrophotometry;    Antioxidative activity
        虎杖系蓼科蓼属植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的根茎和根，具有抗菌、抗病毒等广泛的治疗作用［1］。其主要有效成分为蒽醌类、二苯乙烯类、黄酮类等。随着近年来对其药理作用的深入研究，虎杖的抗氧化作用也日益为人们所重视［2，3］。蒽醌类成分作为虎杖中主要有效成分，在治疗疾病过程中起着较为重要的作用，本实验主要研究了不同提取方法对虎杖中蒽醌类成分及其抗氧化作用的影响，并分析蒽醌类成分和抗氧化活性之间的关系。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器
       JY92-Ⅱ超声波细胞破碎仪，宁波新芝科器所；微波炉，广东美的微波炉制造有限公司；UV-2800紫外分光光度计，尤尼柯（上海）仪器厂；酸度计，意大利哈钠；微量移液器，eppendorf；Sartorius 电子天平（型号1702，称量范围200g，感量0.1mg）,德国Sartorius；FZ102微型植物试样粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；回流提取装置；索氏提取装置。
       1.2  材料
       大黄素对照品（中国药品生物制品检定所，批号110756－200110，供含量测定用，经归一化法标定98.0%）；二苯代苦味酰基自由基(1，1-pheny-2-picrylhydrazyl，DPPH) Sigma；TPTZ（2，4，6-tripyridyl-s-trizine）Sigma；虎杖药材（购自河南仟僖堂医药公司，经河南中医学院曹继华教授鉴定为正品）；其余试剂均为国产分析纯。
       2  方法
       2.1  对照品溶液的制备精密称取大黄素对照品(105℃干燥至恒重)4.1 mg，置50 ml量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度。精密吸取上述溶液1 ml，置10 ml量瓶中，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液至刻度，作为对照品溶液。
       2.2  样品的前处理将虎杖经过干燥，采用微型植物试样粉碎机进行粉碎，过60目筛，粉末经恒温（60℃)干燥24 h后，放干燥器中，备用。
       2.3  供试品溶液的制备
       2.3.1  回流提取液的制备精密称取2.2项下样品约0.5 g，置50 ml的圆底烧瓶中，加70%的乙醇回流提取3次，提取时间分别为1.5，1，1 h，乙醇用量分别为20，15，15 ml，合并3次回流提取液，定容至100 ml的容量瓶中，备用。
       2.3.2  索氏提取液的制备精密称取2.2项下样品约0.5 g，采用70%乙醇进行索氏提取，提取至无颜色为止（约6 h），提取液定容至100 ml的容量瓶中，备用。
       2.3.3  超声提取液的制备精密称取2.2项下样品约0.5 g，置50 ml的三角瓶中，70%的乙醇超声提取3次，3 min/次（辐射时间为10 s/次，间隙10 s，工作18次），乙醇用量分别为20，15 ，15 ml。合并3次的超声提取液，定容置100 ml的容量瓶中，备用。
       2.3.4 微波提取液的制备精密称取2.2项下样品约0.5 g，置50 ml的三角瓶中，70%的乙醇微波提取，提取3次，1 min/次，（工作时间为10 s/次，间隙60 s，工作6次），乙醇用量分别为20，15，15 ml。合并3次的微波提取液，定容置100 ml的容量瓶中备用。
       2.4  蒽醌百分含量的测定
       2.4.1  游离蒽醌百分含量的测定分别精密吸取2.3项下各供试品溶液10 ml，水浴上蒸干，再加20 ml蒸馏水溶解，加氯仿萃取3次（20，15，15 ml），合并3次氯仿萃取液，定容至50 ml的容量瓶中，精密吸取15 ml，水浴上蒸去氯仿，残渣用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解，定容至10 ml的容量瓶中，摇匀，放置20 min。以0.5% 醋酸镁-甲醇溶液为空白，测定其在510 nm处吸光度值。
       2.4.2  总蒽醌百分含量的测定分别精密吸取2.3项下各供试品溶液10 ml，水浴上蒸干，加2.5 mol/L的硫酸20 ml水解2 h，稍冷，加氯仿20 ml继续水解2h。放置至室温后，转移至分液漏斗内，并用氯仿洗涤烧瓶，并入分液漏斗中，分取氯仿层置100 ml的容量瓶中，酸水层继续用氯仿萃取3次（20，15 ，15 ml），并入上述100 ml的容量瓶中，精密吸取30 ml，蒸馏水洗至中性，置水浴上挥干氯仿层，残渣用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解，定容至10 ml的容量瓶中，摇匀，放置20 min。以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白，测定其在510 nm处吸光度值。
       2.5  抗氧化活性的测定
       2.5.1  总抗氧化能力的测定［5］取2.3项下各供试品溶液，适当稀释后移液器取100 μl，加入FRAP工作液（300m mol/L醋酸盐缓冲液，10 m mol/LTPTZ，20m mol/LFeCL3）3ml，混匀反应20 min，于593 nm处读取吸收度，以FeSO4为标准物质绘制标准曲线，样品的抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP单位=1 mmol/L FeSO4，即样品的抗氧化能力相当于FeSO4的 mmol/L数。
       2.5.2  清除自由基能力的测定［6］取2.3项下各供试品溶液，适当稀释后移液器取100 μl，加入2 ml 0.2 m mol/L DPPH的乙醇溶液，混合均匀，黑暗下室温避光反应20 min，在517 nm处测定吸光度，同时以2 ml DPPH+100 μl缓冲溶液混合后的吸光度为空白组，计算清除率/%=［1－药品组A517/空白组A517］×100%。
       2.6  系统适用性实验
       2.6.1  测定波长的选择取大黄素对照品适量，用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解，在360～600 nm 波长间进行扫描，发现大黄素在510 nm 处有最大吸收峰，故选510 nm作为检测波长。见图1。
       2.6.2  线性关系考察精密称取大黄素对照品(105℃干燥至恒重)4.1 mg，置50 ml量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度。精密吸取0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6，2.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加0.5% 醋酸镁-甲醇溶液至刻度，放置20 min。以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为空白，分别测定溶液在510 nm处的吸光度。以吸光度对浓度进行线性回归，得到回归方程： Y=0.044 3X+0.013 7，线性范围为3.28～16.4 μg/ml，r=0.999。
       2.6.3  精密度实验取2.1项对照品溶液，重复测定5次，测得的吸光值RSD为1.3%（n=5）。
       2.6.4  重现性实验取虎杖5份，按2.3.3项下的供试品溶液的制备方法制备，并依2.4项下的方法分别测定游离蒽醌和总蒽醌的吸光值，测得的吸光值RSD分别为2.3%，2.8%（n=5）。
       2.6.5  稳定性实验精密称取大黄素对照品和虎杖适量，按2.1和2.3.3项下的方法制备供试品溶液，并按2.4项下的方法测定，每间隔20 min测定吸光度，共测6次，结果吸光值的RSD分别为0.6%，1.2%，表明大黄素和虎杖样品的吸收度值在2 h内基本稳定。
       2.6.6  加样回收率实验精密称取上述已知含量的虎杖粉末约0.1 g，加入82 μg/ml大黄素甲醇溶液1 ml，按2.3.3项下方法制备供试品溶液，测定回收率，结果平均回收率为97.2%，RSD=2.3%（n=5）。
       2.7  数据统计数据采用SPSS11.0软件进行显著性分析，多重比较采用Duncan检验，以提取方法为控制因素进行相关分析，Excel作图。
       3  结果
       3.1  不同提取方法对虎杖中游离蒽醌含量的影响4种提取方法对虎杖中游离蒽醌的提取含量见图2，从图2中可以看出以索氏提取法为最高，百分含量为0.53%，其次为超声提取，含量为0.45%，微波法为0.25%，回流法为0.12%，并且各种提取方法之间相比差异显著（P＜0.05）。
       3.2  不同提取方法对虎杖中总蒽醌含量的影响不同提取方法对虎杖中总蒽醌含量的影响见图3，在图3中可以看出，对总蒽醌的测定中，索氏提取值为最高，百分含量达到1.16%，超声提取仅次于索氏提取，含量为1.15%，两者相比没有显著性差异（P＞0.05）。回流提取法测得总蒽醌百分含量为0.80%，微波提取法为1.04%，这两种方法与索氏和超声相比差异显著（P＜0.05）。
       3.3  不同提取方法对虎杖抗氧化能力的影响不同提取方法对虎杖抗氧化能力的影响见图4。由图4可知，以回流提取液的抗氧化能力最强，FRAP值为214，其次是微波提取液，FRAP值为195，这两种提取液的抗氧化能力相比差异不显著（P＞0.05），但与超声和索氏的相比有显著性差异（P＜0.05），超声提取液的FRAP值为104，索氏提取液的为90，超声与索氏提取液的抗氧化能力相比无显著性差异（P＞0.05）。
       3.4  不同提取方法对虎杖清除自由基能力的影响不同提取方法对虎杖清除自由基能力的影响。
        见图5，由图5可以看出以回流提取液的清除自由基能力最强，自由基清除率达到63%，其次是微波提取液，达到57%，这两种提取液的抗氧化能力相比差异不显著（P＞0.05），超声与索氏提取液的清除自由基能力分别为32%，27%，二者相比无显著性差异（P＞0.05），回流和微波提取液的抗氧化能力与超声和索氏的提取液相比有显著性差异（P＜0.05）。
       3.5  蒽醌含量与抗氧化活性间的相关关系由表1可以看出，经相关性分析后游离蒽醌的含量与总蒽醌的含量有很强的相关性，相关系数达到0.932 3（P＜0.01），游离蒽醌与FRAP值和自由基清除率也具有很强的负相关，相关系数分别达到-0.983 7（P＜0.001），-0.990 9（P＜0.001），总蒽醌受到游离蒽醌的影响也与FRAP值和自由基清除率具有很强的负相关，相关系数分别为-0.890 2（P＜0.01），-0.895 0（P＜0.01）。表1  游离、总蒽醌与抗氧化活性的相关关系（略）
       4  讨论
       4.1  对蒽醌类成分的显色，常用的显色剂为NaOH，KOH，5%NaOH-2%NH4OH及醋酸镁甲醇溶液。由于前几种显色反应所呈颜色对光及氧不稳定，而且其所呈颜色最大吸收由500～518 nm不等，影响吸收度的测定［4］。笔者曾采用NaOH作显色剂，但不及醋酸镁-甲醇显色稳定，且醋酸镁反应所呈颜色为红色，杂质干扰少。而且其所呈颜色最大吸收在510 nm左右，且显色20 min以后吸收度趋于平稳，因此测定应在20 min～2 h内完成。
       4.2 对总蒽醌成分的测定，酸水解以后，加入氯仿进行两相水解较单纯的酸水解以后氯仿萃取效率较高，因此本实验采用首先酸水解2 h，加入氯仿继续水解2 h的方法，总蒽醌的提取效率增加8%左右。另外，萃取后的氯仿层必须用蒸馏水水洗至中性，否则，会大大影响加入醋酸镁-甲醇以后的吸收度，从而影响试验结果。
       4.3  有效成分的溶出通过润湿－渗透－解吸－溶解－扩散的途径，而提取过程中的外力作用造成表面及细胞组织的破坏，可提高组分的溶出程度，并使溶出过程加速。本实验采用超声细胞破碎提取器进行提取，和一般的超声清洗器相比，功率较高，细胞破碎程度较高，而且，本方法是将超声探头深入到提取液内，因此提取时间短，效率高，但与索氏提取相比，因提取次数较少，残渣中可能残留少量有效成分，因此结果偏低，笔者也曾采用提取4次，5次等方法，结果增加3.0%，5.1%，但考虑提取药物一般采用提取3次的方法，另外为和回流、微波等方法平行，因此仍然使用提取3次的提取液。
       4.4  从整个实验结果来看，索氏提取对游离蒽醌和总蒽醌，提取效率最高，但耗时长达6 h，超声处理仅需3 min。微波提取所得提取液的游离蒽醌百分含量为0.26%，较低，可能是操作时间较短所致，因微波操作过程采用70%乙醇作溶剂，家用微波炉进行提取，功率较高，加热10 s，即需较长的时间冷却，否则，容易暴沸，因此提取时间较短，具体是否为此原因，有待进一步证实。
       4.5  FRAP法其原理是基于氧化还原反应，在较低的pH值下Fe3+与TPTZ形成复合物（Fe3+-TPTZ），在还原物质的作用下，复合物被还原为二价铁的形式，呈现明显的蓝色，在593 nm有最高吸收峰，并且其吸光度的变化与还原物质的含量呈比例关系，可以作为一种测定物质总抗氧化能力的方法;二苯代苦味酰基自由基（DPPH）在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有三个苯环，氮原子上有一个孤对电子，其乙醇溶液呈紫色，在517 nm有强吸收，当加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸光度变小，因此可以测定物质的自由基清除能力。在实验中发现，4种方法的虎杖提取液能够有效的还原Fe3+和清除DPPH自由基，其中回流和微波的提取液的抗氧化活性要强于超声和索式,从相关关系看，其抗氧化活性与提取物中的游离蒽醌含量呈显著负相关，其原因有待进一步研究。
        
       【参考文献】
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