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       【摘要】 
       目的考察脂质体不同制备方法对包封率的影响。方法采用被动载药和主动载药制备脂质体，用微柱离心-紫外分光光度法测定脂质体包封率。结果被动载药法制备脂质体包封率较低，主动载药制备脂质体包封率为84.38%。结论 采用硫酸铵梯度法可制得包封率较高的苦参碱脂质体。
       【关键词】  苦参碱； 脂质体； 主动载药； 被动载药
       
       Preparation of Matrine Liposomes by Active Loading Method
       LIU Wenya，LIU Hanqing
       Nanjing University of Traditional Chinese Medicine, Nanjing 210046, China
       Abstract：ObjectiveTo study the influence of different preparation methods on the entrapment efficiency. Methods  To prepare matrine liposomes by passive loading method and avtive loading method, the entrapment efficiencies were determined by minicolumn centrifuge-UV method. ResultsThe entrapment efficiency with passive loading method was low, while up to 84.38% with active loading method. Conclusion The matrine liposomes with high entrapping efficiency can be prepared by ammonium sulphate gradien method.
       Key words：Matrine;  Liposomes;  Active loading;  Passive loading
        苦参碱是豆科属植物苦参、苦豆子、广豆根等中草药的活性成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗心律失常、抗炎等多种药理作用，尤其抗肝癌活性广泛应用于临床［1］。但现在临床应用的苦参碱制剂存在体内吸收分布广泛、半衰期短、治疗部位药物浓度低、有一定副作用的缺点。将苦参碱制为脂质体，可提高药物的肝靶向性，延长作用时间。
        脂质体制备很多，可分为被动载药和主动载药两大类。本文优选微柱离心法测定脂质体包封率，比较了不同制备方法对其包封率的影响。
       1  仪器和试药
        752紫外光栅分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；RE52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；精密pH计（上海雷磁仪器厂）；SHZ88台式水浴恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂）；苦参碱标准品（中国药品生物制品检定所），卵磷脂（中国医药（集团）上海化学试剂公司）；胆固醇（北京奥博星生物技术责任有限公司）；葡聚糖凝胶G50（天津化学试剂二厂）；溴代麝香草酚兰（上海试剂三厂）；其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  被动载药和主动载药制备脂质体下列制备方法中，磷脂与胆固醇配比为3∶1，药物最终浓度为2 mg/ml，磷酸盐缓冲液pH6.8。
       2.1.1  被动载药乙醚注入法：将磷脂和胆固醇溶于适量乙醚中，电磁搅拌下，用注射针头注入溶有苦参碱的磷酸盐缓冲液中，继续搅拌至挥尽有机溶剂，即得。薄膜分散法：将磷脂和胆固醇溶于适量氯仿中，30℃减压旋转蒸发，除去氯仿成膜，加入溶有苦参碱的磷酸盐缓冲液，恒温摇床振摇20 min，搅拌，即得。逆相蒸发法：将磷脂和胆固醇溶于氯仿中，加入溶有苦参碱的磷酸盐缓冲液，油水两相旋摇后置于超声仪中超声10 min，直至形成稳定的W/O型乳剂，所得乳剂在旋转蒸发仪（48℃）上减压除去氯仿，再加适量磷酸盐缓冲液继续减压除去剩余氯仿，并洗下壁上的凝胶。水浴，使磷脂充分水合，再进行短时超声，即得。冻融法：结合其它方法，将制得脂质体放冰箱中冷冻，再在室温中融化，如此反复几次。
       2.1.2  主动载药硫酸铵梯度法［2，3］：将磷脂和胆固醇溶于氯仿中，减压蒸发，制备磷脂膜，加入200   mmol/L的硫酸铵溶液（预热至50℃），旋转蒸发，至50℃水浴中水化1 h，超声10 min，得空白脂质体。将空白脂质体依次通过0.8，0.65，0.45和0.22  μm的微孔滤膜，进行整粒。整粒后脂质体装入透析袋中，置于100倍体积的0.9%NaCl溶液中透析24 h，每隔一定时间更换透析液，共3次。取此空白脂质体，加入溶有苦参碱的磷酸盐缓冲液，40℃水浴孵化5 min。
       2.2  包封率测定方法建立
       2.2.1  脂质体中药物含量的测定取苦参碱标准品适量，用磷酸盐缓冲液溶解，稀释至一定浓度（1 mg/ml），与溴代麝香草酚兰络和显色，于413 nm处测定氯仿层吸光度A为0.327。另取磷酸盐缓冲液5份，用HCl调pH分别为7.0，6.0，5.0，3.0，1.0。用上述5种溶液分别配制1 mg/ml的苦参碱溶液，将每种溶液分成两份，其中一份加入适量氯仿，摇匀，3 000 r/min离心10 min，取上清液调pH值至7.0并定容，与溴代麝香草酚兰络和显色［4］，于413 nm处测定氯仿层吸光度A（1）； 另一份中加入空白脂质体适量，同法测吸光度值A（2），结果见表1和图1。可见，溶液pH值对氯仿萃取回收率影响显著，当pH达到1.0时，回收率接近100%，因此，实验采用先调低pH值，再进行氯仿萃取的方法，可有效分离主药与脂质体膜材，为紫外分光光度法测定苦参碱脂质体中苦参碱含量奠定了基础。表1  不同pH值苦参碱回收率比较（略）
       2.2.2  透析法测包封率［5］透析时间的确定：精密吸取苦参碱磷酸盐缓冲液2 ml入透析袋中，扎紧上口，至磷酸盐缓冲液20 ml中，置于恒温水浴中振荡，每隔1 h取样5 ml并补充等体积磷酸盐缓冲液，样液以磷酸盐缓冲液为空白，测定吸收度，由结果知9 h可达到透析平衡，透析袋内外苦参碱浓度相等。
       
        精密吸取空白脂质体2 ml入透析袋中，置磷酸盐缓冲液中透析，每1 h更换透析液，测吸光度，结果空白脂质体在12 h后开始在透析外液中被检出。故确定透析时间为9 h。
        苦参碱脂质体包封率测定：精密吸取苦参碱脂质体2 ml入透析袋中，扎紧上口，至磷酸盐缓冲液20 ml中透析，每隔1 h取样5 ml并补充等体积磷酸盐缓冲液，共收集9 h透析液，定容，作为供试样品透析液。精密吸取空白脂质体同法操作，以空白脂质体的透析液为参比，测样品透析液的吸光度A外 ，根据标准曲线计算透过药量C外。
        另精密吸取苦参碱脂质体2 ml，照苦参碱脂质体含量测定方法，测定脂质体中苦参碱总药量C总。
        包封率＝C总－C外C总
       2.2.3  微柱离心法测包封率［6］凝胶柱的处理：称取适量Sephadex G-50，加水，在近沸水浴中将湿凝胶逐渐升温溶胀，大约需要5 h，放冷备用。
        空白脂质体与游离药物的柱分离：微型柱的制备：5 ml塑料注射器，底部有一塑料板和玻璃棉，先用蒸馏水洗注射器，再用磷酸盐缓冲液洗。取充分溶胀的Sephadex G-50适量，装入其中(约5 cm)。将注射器针筒放入一干净的离心管中离心5 min(2000 r/min)，去水备用。
        精密吸取空白脂质体、游离药物各0.5 ml，分别上样，于离心机中离心3 min(1500 r/min)，用0.5 ml磷酸盐缓冲液洗脱，离心3  min(1500 r/min)，收集洗脱液，再用0.5 ml磷酸盐缓冲液洗脱，重复上述操作若干次，将每次收集的洗脱液稀释至5 ml，测定吸光度A，以A对洗脱液的累积体积V作图，见图2。
         由分离曲线可知，经磷酸盐缓冲液洗脱两次后空白脂质体几乎全部被洗脱下来，因此只收集前两次的洗脱液，合并，测定包封率。
        苦参碱脂质体包封率测定：精密吸取苦参碱脂质体0.5 ml加入微型柱上照2.2.3项下离心，加入0.5 ml磷酸盐缓冲液洗脱，离心；再加入0.5 ml磷酸盐缓冲液，离心，收集洗脱液，测定吸光度，计算游离药物量W游。
        另精密吸取苦参碱脂质体0.5 ml，照苦参碱脂质体含量测定方法，测定脂质体中苦参碱的总药量W总。
        包封率＝（W总－W游）W总
        上述包封率测定中所用脂质体均为硫酸铵梯度法制备，透析法测得包封率为58.69%，微柱离心法测得包封率为85.47%。故采用微柱离心法测包封率较好。
        用微柱离心法分别测定被动载药和主动载药法制备的脂质体包封率，结果见表2。表2  不同制备方法包封率比较（略）
        由结果可知，主动载药硫酸铵梯度法制得的脂质体包封率最高。
       3  讨论
       
       3.1  在酸性染料比色法测定苦参碱含量时，脂质体膜材在413 nm处也有吸收，对主药测定有干扰，必须进行预处理消除膜材的干扰，再测主药含量。曾用Triton X－100破乳，但破乳剂对测定有干扰；此外还用甲醇溶解脂质体后离心，无法消除膜材对测定的干扰。实验采用先调低pH再进行氯仿萃取的方法，有效的实现了主药与膜材的分离。从试验数据看出磷脂作为表面活性剂能增加苦参碱在氯仿中的分配，随着溶液pH值的降低，药物在水相中分配比例不断增大，当pH达到1.0时，回收率接近100%，可作为测定脂质体中药物含量前处理的方法。
       3.2  脂质体包封率测定的方法有超滤法、透析法、柱层析法、微柱离心法等。超滤法对实验设备要求较高，故未采用；柱层析法则由于大量洗脱液的稀释，药物含量很低，造成含量测定的困难，且大量稀释也引起脂质体中药物渗漏；从所得试验数据可知透析法包封率较低，可能是稀释后引起脂质体的破裂，且透析所需时间长，故不适用；用微柱离心法进行包封率测定，耗时短，脂质体溶液稀释倍数小，且不需要昂贵的仪器设备。
       3.3  被动载药几种制备方法制备的脂质体包封率较低，而采用主动载药法制得的脂质体包封率可达到80%以上。硫酸铵梯度法是利用硫酸铵溶液作为水相，首先制备内外均含有硫酸铵的脂质体，然后通过除去脂质体外水溶液中的硫酸铵,使得脂质体内的硫酸铵浓度与外水相的硫酸铵形成浓度梯度,内水相的NH4+分解成NH3和H+，导致脂质体内外的H+离子浓度差，即pH梯度，使得外水相中分子态的苦参碱进入内水相后遇酸性环境变成离子态，无法通过脂质双层回到外水相，从而使得脂质体不易泄漏,更加稳定。
        
       【参考文献】
         　　［1］蔡宝仁，汤苏阳.苦参类生物碱的研究进展和临床应用［J］.医学信息(西安)，2001，14(4)：236.
       
       ［2］邓意辉,王绍宁.主动载药法制备盐酸小檗碱脂质体［J］.中南药学杂志，2004,39(1)：40.
       
       ［3］邓意辉,李焕秋,王绍宁，等.主动载药与被动载药制备左氧氟沙星脂质体［J］.中国抗生素杂志，2001,26(4)：258.
       
       ［4］刘 斌,石任兵,周素蓉.苦参汤有效部位总生物碱含量测定方法研究［J］.北京中医药大学学报，2004,27(2)：76.
       
       ［5］吕文莉,郭健新,平其能. 灯盏花素脂质体的制备及其理化性质的测定［J］.中国天然药物，2004，2(5)：290.
       
       ［6］王秀敏,邓英杰,郝艳丽，等.微柱离心-气相色谱法测定β-榄香烯脂质体包封率［J］.沈阳药科大学学报，2004，21(6)：416.