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       【摘要】 
       目的从尖吻蝮蛇毒中分离纯化一种小分子活性肽K组分, 测定其理化性质及生物学活性。方法经Sephadex G75凝胶过滤, 超滤，DEAESepharose CL6B离子交换层析法分离纯化活性肽K，采用高效液相鉴定纯度，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）测定其分子量，等电聚焦法测定等电点，用比浊法测定其抗血小板聚集活性，通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM) 实验检测K组分对血管生成的影响。 结果从尖吻蝮蛇毒中分离相对分子量约为7 862D，等电点为4.29的组分。该组分能抑制由二磷酸腺苷（ADP）、胶原（collagen）、凝血酶（thrombin）诱导的血小板聚集并成剂量依赖性；具有抑制鸡胚尿囊膜血管生成的作用。结论 从尖吻蝮蛇毒中纯化出活性肽K，该组分有很强的抗血小板聚集和抗血管生成作用。
       【关键词】  尖吻蝮蛇毒； 血小板聚集抑制； 抗血管生成
       基金项目：广西壮族自治区自然科学基金资助项目（No.0575062）
       The Study of Peptide in Agkistrod on Acutus Snake Venom
       LEI Danqing, ZHOU Xianli,LI Yingxin
       (The Institute of Snake Venom Research of Guangxi Medical University, Nanning, 530021，China)
       Abstract：ObjectiveTo purify a peptide from Agkistrodon Acutus snake venom and analyse its characteristics and biological activities.Methods To extract snake venom through 75 gel filtration, ultrafiltration and DEAE Sepharose CL6B ionexchange. The purified product was identified by HPLC. The molecular weight was determined by SDSpolyacrylamid gel electrphoresis. The isoelectric point was estimated by the isoelectric focusing electrophoresis. Platelet aggragation was measured by nephelometry. The antiangiogenesis effect in vivo of peptide  on CAM assay was observed.ResultsThe molecular weight of peptide purified from Agkistrodon Acutus snake venom was 7 862D. Its isoelectric point was pH4.29. This peptide could dosedependently inhibited the platelet aggregation induced by ADP, collagen and thrombin.It inhibit the spontaneous angiogenesis of CAM.ConclusionThe method has been proved to be successful for the purification of peptide that inhibits platelet aggregation and angiogenesis
       Key words：Agkistrodon acutus venom；  Platelet aggregation inhibitor；  Angiogenesis；
       
       蛇毒是蛇毒腺分泌的一种天然毒蛋白，含多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质，具有广泛的生物活性。我国西汉《神农本草经》已有利用蛇类的记载，中医也有利用蛇毒“以毒攻毒”来治疗某些“疑难杂症”的经验和传统。唐代《本草拾遗》中记载了有关蛇可以祛风燥湿、通络活血，用于治疗风湿痹痛、四肢麻木等病症。明代李时珍在《本草纲目》中详细的描述了蝮蛇能治疗恶疮、半身枯死等重疾。在现代医学中，对蛇的临床作用的研究主要集中在对蛇毒各组分的生物学特点研究上，研究者发现蛇毒具有消除血栓、止血、镇痛等作用。1987年Huang TF等［1］从棕点竹叶青蛇（Trimeresurus gramineus）毒分离提纯第一个去整合素trigramin,并作为血小板抑制剂报道，目前至少发现有四十余种去整合素，由于其在抗血小板聚集、抗肿瘤以及抗肿瘤转移中展示出良好的应用前景，成为国内外关注的研究领域，但其含量很少，国内尚未见报道从尖吻蝮蛇毒中分离纯化得到天然的去整合素。本文的目的旨在从尖吻蝮蛇毒中分离出具有去整合素性质的活性肽K，并对它的理化性质和生物活性进行研究。
       1  材料
       1.1  药品和试剂 尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒冻干品由广西医科大学蛇毒研究所提供；正常血浆由健康志愿者捐赠；鸡胚种蛋购自南宁市良凤农牧有限责任公司。Sephadex G75, DEAE-sephrose CL6B,为Pharmacia公司产品。ADP，胶原,为Sigma公司产品。低分子量标准蛋白(251216949)为Amersham Bioscience公司产品，其它试剂均为国产分析纯。
       1.2   仪器蛋白纯化分析系统(GradiFrac System with Hiload Pump P50)为Pharmacia Biotech公司产品。MiniProtean 3 小型垂直电泳仪，Model 111 Mini  IEF Cell等电聚焦电泳仪均为BioRad公司产品。AG245型电子分析天平为瑞士梅特勒公司制造；DELTA 320 pH计为梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司产品。TYXN96多功能智能血液凝集仪为上海海特医学设备有限公司产品。753B紫外分光光度计，为上海光学仪器厂制造。
       2  方法
       2.1  尖吻蝮蛇毒活性肽K分离制备 取2.0 g蛇毒溶于0.02 mol·L-1碳酸氢氨缓冲液10 ml中,4 000 r· min-1离心30 min。取上清液上Sephadex G75柱,用0.02 mol·L-1碳酸氢氨缓冲液洗脱（流速24 ml·h-1），收集具有抑制血小板聚集的活性峰，将收集的溶液加入超滤系统内进行超滤（超滤膜截流分子量10 000 D）同时视体积下降情况多次补充缓冲液，收集滤出液后冻干，用以进一步纯化。 将冻干组分溶于0.01 mol·L-1醋酸铵(pH=8.5)缓冲液中，上DEAE Sepharose CL6B柱,用0.05 mol·L-1pH8.5至1.0 mol·L-1pH 6.0,400 ml醋酸铵缓冲液进行梯度洗脱（ 流速24 ml·L-1），收集具有抑制血小板聚集的活性峰，冻干保存备用。
       2.2  纯度鉴定  RP-HPLC法 色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18柱(25 cm×4.6 mm(ID),粒度5 μm)；柱温40℃；流速1.0 ml·min-1；检测波长208 nm；进样量10 μl。流动相A 0.1%三氟醋酸，B 100%乙腈含0.1%三氟醋酸30 min内以16%～18%的梯度洗脱。
       2.3  分子量的测定 采用郭尧君［2］方法并加以改进，分离胶凝胶浓度为16%，交联度为6%；浓缩胶凝胶浓度为4%，交联度为3%，；胶缓冲液为3.0 mol·L-1 TrisHCl(含质量分数为0.3%的SDS) pH8.4。阳极缓冲液为0.2mol·L-1 Tris，pH8.9；阴极缓冲液为0.1 mol·L-1的Tris,0.1 mol·L-1 Tricine和0.01 g·L-1的SDS，pH 8.25。
       2.4  等电点的测定 用Model 111 Mini  IEF Cell系统制胶，T=5%,两性电解质Ampholine(pH3～10)浓度为3%。电泳方法严格按照BioRad公司说明书中所说的进行，100 V电泳15 min,200 V电泳15 min,450 V电泳180 min.从阴极到阳极切下0.5 cm×1.0 cm的凝胶，分别置装有1 cm去离子水试管中捣碎，再分别测定pH 值，作出不同位置凝胶段的pH值参照曲线。根据样品在凝胶条中的位置，测出样品的 pH值。
       2.5  抗血小板聚集活性的测定 血标本采自2周内未服用任何药物健康志愿者,全血9∶1体积比加入质量分数为3.8%的枸橼酸钠,室温1 000 r·min-1离心10 min,取上层血浆即为富血小板血浆(PRP),剩余部分3 000 r· min-1再离心10 min,所得上清为贫血小板血浆(PPP)，将PRP与部分PPP混合使最终血小板数目为3.5×108· ml-1.血小板聚集实验在血小板聚集仪上进行.分别取200 μl PRP与10 μl不同浓度的样品于比浊管中在37°C温育5 min，然后加入ADP(230 μmol·L-1)10 μl, 胶原 (100 μg·ml-1) 10 μl,凝血酶(1U·ml-1)10 μl绘制5 min内的聚集曲线.
       2.6  鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验 室温下将鸡胚种蛋浸泡于新洁尔灭水溶液5～10 min，拭干后将鸡蛋气室（蛋胚大头端）向上，长轴与蛋托呈45°，温度在（37.6±0.2）℃，相对湿度为60%的孵化箱中孵育。转蛋不少于2次/d，转蛋角度以水平位置前俯后仰各45°为宜。新鲜种蛋孵化第5天，在超净台上将蛋胚用酒精消毒后用镊子在蛋胚顶端戳一小口，然后小心地去掉周围的蛋壳和壳膜，使开口约为1.5 cm×1.5 cm大小。此时可以看到气室底部隔着一气室膜就是CAM膜了，并且可以清楚地看到CAM膜上血管网的大小和分布位置以及跳动的鸡胚心脏。确定加样部位后小心地用注射针头从气室与卵黄分隔处挑破气室膜，暴露下层的CAM膜。样品事先以体积10 μl加到5 mm×5 mm大小的灭菌定性滤纸上风干后，用镊子轻轻将载样滤纸置于CAM和卵黄囊膜处血管较少的部位，然后用灭菌透明胶封口，继续孵育。48 h后在解剖显微镜下观察并拍照。
       3  结果
       3.1  尖吻蝮蛇毒活性肽K的分离纯化 将尖吻蝮蛇毒粗毒过Sephadex G75凝胶过滤后得5个峰，其中第5个峰具有抗血小板聚集活性。经超滤系统进行超滤后，再用DEAESephrose CL6B离子交换柱进一步分离得4个峰，第4与第5个峰之间具有抗血小板聚集活性。
       3.2  高效液相色谱分析活性肽K纯度经前述步骤分离得到的组分经RPHPLC 分析，呈现单峰型，说明我们分离的活性肽K为单一组分HPLC C18显示：该组分呈单一峰。结果见图1。
       图1  HPLC C18分析尖吻蝮蛇毒活性肽K图谱（略）
       3.3  相对分子量测定 还原性和非还原性SDSPAGE鉴定蛇毒组分均为单一区带。据标准蛋白得到回归曲线(Y=4.859 21.860 7X，r=0.990 4),算出相对分子量为7 862 D左右，电泳结果见图2。
       3.4  等电点 该组分经等电聚焦为一条带，根据浸泡法得到凝胶梯度的回归曲线（Y=2.904 6+1.158 4X，r=0.981 0）测得小分子多肽的等电点为4.29。
       图2  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱（略）
       3.5  血小板聚集实验 如图3所示，该组分对由ADP、胶原（Collagen）、凝血酶（Thrombin）诱导血小板聚集具有很强抑制作用。剂量与抑制率成量效关系。
       图3  活性肽K对血小板聚集的影响（略）
       3.6  通过体内鸡胚绒毛尿囊膜模型评价活性肽K抗血管生成作用。孵化7 d的鸡蛋，空白对照血管生成清晰可见（图4a），分别加入不同浓度的血小板抑制因子10，20，100 μmol·L-1，结果发现对血管生长呈剂量依赖性（图4 b～d）。
       图4  活性肽K对血管生成的影响（略）
       4  讨论
       
       去整合素主要的生物学活性之一就是抑制血小板聚集活性。血小板膜表面的糖蛋白受体分两类，即整合素类和非整合素类。整合素类糖蛋白受体由 α 和 β 两个亚单位组成，共同参与血小板的黏附与聚集。血小板膜上的糖蛋白ⅡbⅢa，是纤维蛋白原的受体，当血小板被激动剂如ADP、胶原、凝血酶、肾上腺素等刺激后，血小板表面的糖蛋白ⅡbⅢa 受体就暴露出纤维蛋白原的受体使纤维蛋白原与之结合，从而导致血小板聚集。去整合素还可以与表达于血管内皮细胞和某些肿瘤细胞表面的整合素αvβ3，α5β1结合，抑制血管生成以及肿瘤转移。我们的实验证明了组分K的这些生物活性。
       
       本研究将抑制血小板聚集的活性作为活性检测指标，从蛇毒中分离纯化所需组分。首先选用Superdex G75凝胶过滤层析柱分离尖吻蝮蛇毒粗毒，除去大分子组分。将凝胶过滤所获的的活性组分，在超滤膜截流分子量为10 000 D的超滤系统中进一步除去大分子组分。另外，据研究报道去整合素等电点在5左右［3］，我们采用了DEAEsephrose CL6B离子交换层析柱，用pH 8.5和pH 6.0醋酸铵缓冲液进行梯度洗脱，使盐浓度和pH值都不算太高的情况下，即可得到很好的分离效果。活性肽K对ADP、胶原、凝血酶诱导的血小板聚集均有很好的抑制作用，并呈现一定的剂量依赖关系。结果表明K组分对引起血小板活化的几条途径均发生影响，提示K组分可能通过作用于血小板聚集过程中的某一共同环节，来抑制血小板的聚集。
       
       持续的血管生成是肿瘤生长的特征。血管生成不但是肿瘤生长所必需的，而且肿瘤细胞与新生血管系统的接触还是导致远处转移的原因。利用抗血管生成来进行肿瘤防治理论［4］提出以来，对各种因子在体内外环境下对血管生成作用的研究得到了飞速的发展。目前，抗肿瘤血管的研究依赖于体内或体外的试验如动物角膜或虹膜内移植，兔耳廓和动物内皮肤移植，颅窗软脑膜血管的观察，小鼠胚胎内血管生成的观察，鸡胚绒毛尿囊膜血管生成观察等［5～7］。鸡胚绒毛尿囊膜技术，在众多的体内血管生成抑制的实验方法中最为经济实用。蛇毒去整合素（Disintergrin）是一类富含半光氨酸，多含RGD的多肽，广泛存在于蝮亚科和蝰亚科蛇毒中，对血小板聚集和血管生成有抑制作用。本课题获得的活性肽K组分在体内鸡胚尿囊膜血管生成模型中抑制血管生成，其生物活性与已报道的Disintergrin有一定类似，分子量和等电点也接近［8，9］。因此我们推测组分K可能是含RGD肽的去整合素物质，本文是首次报道从尖吻蝮蛇毒中获得天然的抗血管生成的小分子肽，它活性的本质和作用是否确与结构中含RGD功能区有关，有待进一步的研究。
       【参考文献】
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