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       【摘要】 
       目的建立测定虎舌红总生物碱的含量测定方法。方法采用溶剂萃取酸性染料比色法测定，以去氢飞廉碱（C16H22N4O2）为对照品，溴甲酚绿为酸性染料，用氯仿萃取，检测波长418 nm。结果去氢飞廉碱在0.72～14.02 mg/L范围内与吸光度呈良好线性关系，回归方程为：Y=19.254X-1.6247,r=0.999 5(n=5)，平均回收率为101.65%，RSD为0.75%（n=5）。结论所建立方法简便、准确、选择性强。
       【关键词】  虎舌红总生物碱； 酸性染料比色法； 去氢飞廉碱
       基金项目：仲恺农业技术学院科研基金资助项目（No.G3052727）
       Determination of the Total Alkaloids in Ardisia mamillata by Acid Dye Colorimetry
       LING Yuzhao，YANG Miaoxian
       (Department of Chemistry and Chemical Engineering, Zhongkai Agritechnological College,Guangzhou 510225,China)
       Abstract：ObjectiveTo establish a method for quantitative determination of the total alkaloids in the root of Ardisia mamillata.MethodsThe content was determined by solvent extraction and acid dye colorimetiy, with Acanthoine Ruscope-ine （C16H22N4O2） as a control criterion and bromocresol green as the acid dye, and the wavelength was at 418 nm. ResultsAcanthoine Ruscope-ine showed a good linear relationship with absorbance when its concentration was within 0.72～14.02 mg/L. The regression equation established was Y=19.254X-1.624 7,r=0.999 5(n=5). The recovery of Acanthoine Ruscope-ine was 101.65%,RSD was 0.75% (n=5).ConclusionThis method is easy, accurate and specific.
       Key words：Ardisia mamillata total Alkaloid;  Acid Dye Colorimetiy;  Acanthoine Ruscope-ine
       
       虎舌红Ardisia mamillata，又名红毛毡、宝鼎红、天仙红衣、毛凉伞、金丝红珠等，为紫金牛科紫金牛属。原产我国，分布于福建、广西、广东、云南、四川、贵州、江西等地。虎舌红叶片紫红色，果实鲜红色，叶果并美，是室内观叶植物的首选佳品［1］。《云南中草药选》中记载虎舌红全草可入药，有清热利湿、活血止血、去腐生肌等功效，对跌打损伤、风湿骨痛、肺痨咳嗽、疳积肝炎均有疗效［2］，生物碱是其主要活性成分［3］。本文以虎舌红中的主要成分总生物碱为指标，建立虎舌红总生物碱的含量测定方法。现报道如下。
       1  器材
       
       752C紫外-可见分光光度计(上海第三分析析仪器厂)；PHS-2型酸度计(上海雷磁仪器厂)；FA-1004电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。
       
       实验所用虎舌红全草采于封开黑石顶森林保护区，经本校植物研究室鉴定为紫金牛科(Myrsinacese)、紫金牛属（Ardisia）虎舌红（A.mamillata）。去氢飞廉碱对照品（中国药品生物制品检定所）；溴甲酚绿（北京化工厂）；其它试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  供试液制备
       2.1.1  供试品溶液的配制  称取虎舌红粉末200 g，用10倍量pH=3的75%乙醇分3次加热回流提取，3 h/次，得醇取液，60℃下减压浓缩得浸膏；用2%盐酸溶解，过滤除去不溶性非碱性脂溶性杂质，用乙醚、氯仿洗涤3次除去亲脂性非生物碱类成分，然后加浓氨水调pH值为6～7，过滤除去鞣质类杂质沉淀，再用氨水调pH至10～11后，用氯仿萃取，萃取液置50 ml容量瓶中，用1 mol·L-1醋酸钠调至pH值为5.5，摇匀，用pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲液稀释至刻度，即得供试品溶液。
       2.1.2  对照品溶液的配制精密称取去氢飞廉碱20 mg，置50 ml容量瓶中，加pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲液溶解并稀释至刻度，得对照品贮备液。精密吸取1 ml贮备液置50 ml容量瓶中，加上述缓冲液稀释至刻度，得对照品溶液。
       2.1.3  酸性染料、缓冲溶液的配制　酸性染料选择常用的溴甲酚绿或溴麝香草酚蓝，其溶液均按《中国药典》方法［4］配制。pH 4.5，pH 5.0，pH 5.5，pH 6.0醋酸-醋酸钠缓冲液均按文献方法配制。
       2.2  实验条件的选择
       2.2.1  测定波长的确定取对照品溶液、供试品溶液20μl置25 ml具塞试管中，精密加入pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲液3 ml，溴甲酚绿染料2 ml，氯仿10 ml，密塞，剧烈振摇2 min，转移至分液漏斗中静置2 h，分取氯仿层，于200～900 nm之间进行波长扫描。结果表明，对照品溶液、虎舌红供试品提取液在418 nm处吸收最强，最终选定418 nm为检测波长，吸收光谱见图1。
       a虎舌红供试品溶液    b对照品溶液
       图1  供试品溶液、对照品溶液波长扫描图（略）
       2.2.2  酸性染料用量的选择精密吸取对照品溶液1 ml，分别精密加入0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mg·ml-1的溴甲酚绿溶液2 ml，其余同样品测定项下操作，结果表明在本实验条件下，酸性染料达0.9 mg·ml-1时有最大吸收。
       2.2.3  缓冲液pH值的选择　取0.1 mol·L-1醋酸钠溶液与0.1 mol·L-1醋酸溶液配制成pH值分别为4.5，5.0，5.5，6.0，6.5的缓冲液；精密吸取2 ml对照品溶液，分别加入不同pH值的缓冲液3 ml及其配制的溴甲酚绿溶液2 ml，按样品测定项下操作。结果表明，当缓冲液pH值为5.5时，吸光度最大，即灵敏度最高。
       2.3  线性范围的考察精密吸取对照品溶液（2.0 g/L）0.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0，30.0，35.0，40.0，45.0，50.0 μl分别置于25 ml具塞试管中，分别加入pH 5.5醋酸-醋酸钠缓冲液3 ml，酸性染料溶液2 ml，氯仿10 ml，密塞，剧烈振摇2 min，转移至分液漏斗中，静置2 h，分取氯仿层于418 nm测定吸光度。以去氢飞廉碱对照品浓度对吸光度进行线性回归，得回归方程：Y=19.254X-1.6247，r=0.999 5（n=5）。结果表明，去氢飞廉碱在0.72～14.02 mg/L范围内呈良好的线性关系。
       2.4  精密度考察精密吸取同一供试品溶液5份，每份25 μl，按照2.3项下的方法进行操作，测定吸光度，计算样品含量，RSD为1.68%（n=5）。表明该方法精密度良好。
       2.5  重现性考察取同一批供试样品，按2.1.1项下配制成供试品溶液，按2.3项下方法测定，得以去氢飞廉碱计的总生物碱平均含量为16.61%，RSD为2.51%。表明该方法重现性良好。
       2.6  样品稳定性考察精密吸取供试品溶液25 μl，分别在制备后1，2，4，6，8，10，12，24，48 h时按照2.3项下的方法进行操作，测定吸光度，计算含量，得总生物碱平均含量为16.46%，RSD为1.70%，结果表明样品溶液在12 h内稳定。
       2.7  样品含量测定精密称取3批样品（自制），按2.1.1项方法制备，再分别吸取25 μl，按照2.3项的方法进行操作，测定吸光度，计算出虎舌红（以去氢飞廉碱计）总生物碱含量为16.45%，结果见表1。
       表1  样品含量测定结果（略）
       2.8  回收率实验精密称定虎舌红粉末0.1 g（相当于虎舌红总生物碱1.681 mg），置于10 ml容量瓶中，用0.1 moL/L盐酸溶解并定容制备成样品溶液，取样品溶液5份，每份10 μl，分别加入浓度为2.032 g/L对照品溶液30 μl，按2.3项方法操作，测定吸光度，计算平均回收率为101.65%，RSD为0.75%。结果见表2。
       3  讨论
       
       《中国药典》1995版中生物碱的含量测定采用氨水碱化后氯仿提取的方法，因虎舌红总生物碱有一定的水溶性，用氯仿难以提取完全，使测定结果偏低。而酸性染料分光光度法使虎舌红总生物碱在微酸性条件下，与溴甲酚绿络合成可被氯仿萃取的有色离子对，在418 nm处有最大吸收。该方法专属性强，测定结果更准确［5］。
       表2  回收率实验结果（略）
       虎舌红总碱在酸性条件下游离成生物碱后，若用酸碱滴定法，则有测定时间长、取样量大、操作步骤多、氯仿用量大、滴定终点不易掌握等缺点；而酸性染料比色法简便、易操作，准确度高。在实验过程中，样品加入溴甲酚绿缓冲液及氯仿后，要充分振摇2 min，以保证生物碱与溴甲酚绿形成的离子对充分转移到氯仿中，使萃取完全。在样品稳定性实验中，样品在被碱化12 h内含量基本没有改变，24 h时开始有下降，48 h时含量下降10%，因此进行测定时应在样品处理12 h内。
       
       实验表明，使用酸性染料比色法测定，具有良好的线性关系，且方法简便、准确、专属性强，可用于虎舌红总生物碱的含量测定及质量控制。
        
       【参考文献】
         　　［1］ 卢其能.虎舌红的生物学特性与组织培养研究［J］.江西林业科技,2002，1:5.
       
       ［2］ 赵 亚,刘合刚.紫金牛属植物研究近况［J］.中草药,1999,30(3):228.
       
       ［3］ 凌育赵,曾满枝, 严志云.超临界萃取气-质联用分析虎舌红挥发油化学成分［J］.精细化工,2005,22(10):766.
       
       ［4］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：人民卫生出版社,2000：299.
       
       ［5］ 宋学华,宋党明.苦豆草中总生物碱的含量测定［J］.中草药，1991，22（10）：444.