文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的测定甘草样品润制前和润制后多糖、甘草苷、甘草酸、总黄酮4种成分的含量，比较润制过程对4种成分含量的影响。方法采用高效液相色谱法测定甘草苷和甘草酸含量；紫外分光光度法测定多糖和总黄酮含量。结果通过对样品水处理前后4个成分测定结果分别进行配对t检验，甘草4种成分含量水处理前后均有显著差异。水处理后多糖含量升高22.74%，甘草苷含量降低17.38%，甘草酸含量降低7.45%，黄酮含量降低9.49%。结论 水处理使甘草中多数成分含量显著降低,而多糖含量显著升高，其含量变化原因应做进一步深入研究。
       【关键词】  甘草； 水处理； 多糖； 甘草苷； 甘草酸； 黄酮
       基金项目：国家自然科学基金项目（No.30572328）
       Comparison of the Active Components in Glycyrrhiza uralensis Fisch Processed by Water
       FENG Wei，  WANG Wenquan*，ZHAO Pingran，CHEN Yunhua ，LIU Li
       (Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China; Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017,China)
       Abstract：ObjectiveTo determine and compare the four components in Glycyrrhiza uralensis Fisch and the same samples processed by water. Methods To determine the contents by ultraviolet spectrophotometry and high performance liquid chromatography. ResultsBy the pairedsamples T test of the data, the difference between the original and the water-processed has statistical meaning. ConclusionWaterprocessing causes the contents of general flavonoides, liquiritin and glycyrrhizic acid to decrease, and the content of polysaccharide to increase. Reason for the increase should be that water-processing can promote dissolution of polysaccharide. The study is to be pursued further.
       Key words：Glycyrrhiza;   Waterprocessing;   Polybotys;  Liquiritin;  Glycyrrhizicacid;  Flavonoids
       
       甘草中主要活性成分有甘草酸、甘草苷、多糖和黄酮等成分［1～7］，其中甘草酸常以钾盐和钙盐的形式存在, 称为甘草素［8］，易溶于水生成一分子的甘草次酸和二分子的葡萄糖醛酸［9］，此外多糖以及总黄酮中的苷类也在水中有一定溶解性。在临床和制剂中甘草饮片的用量较大,为了便于饮片的切制和保证饮片的外观质量，通常对甘草进行水处理使之软化，常用水处理的方法有淋法、洗法、泡法、漂法、润法、蒸法等［10，11］。甘草的水处理多遵循少泡多润的原则。但常常因炮制的方法不当, 而使饮片的质量严重下降［8，9，12～14］。本实验对甘草软化中水处理对饮片质量的影响从甘草酸、甘草苷、多糖和总黄酮4个成分含量变化进行了考察。
       1  仪器及试药
       1.1  甘草药材甘草生药样品由北京中医药大学王文全教授提供和鉴定，为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.样品编号为：1.甘肃酒泉野生;2.甘肃张掖野生;3.金塔6年生栽培;4.白城4年生栽培;5.金塔3年生栽培；1R.甘肃酒泉野生润制;2R.甘肃张掖野生润制;3R.金塔6年生栽培润制;4R.白城4年生栽培润制;5R.金塔3年生栽培润制；样品全部为根部。60℃干燥过夜并粉碎。
       1.2   仪器及数据处理软件  安捷伦1100型高效液相色谱仪，Agilent 1100 色谱工作站；SPSS 10.0统计软件；UV2100型分光光度计（UNICO仪器有限公司）；KQ500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-6型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）FW100粉碎机；Sartorius BS110S  1/万、BP211D 1/（10万）电子分析天平；SHBⅢ循环水式多用真空泵；10～100 ml，100～1 000 ml,500～5 000 ml eppendorf加液枪。
       1.3  试剂  供含量测定用甘草酸铵（编号：110731）、甘草苷（编号：111610）：中国药品生物制品检定所；葡萄糖对照品为分析纯：D(+)Glucose北京拜尔迪生物公司；硫酸、苯酚、冰醋酸、乙醇均为分析纯；CALEDON色谱纯乙腈；分析纯甲醇、冰醋酸，化学纯醋酸铵；市售的娃哈哈纯净水。
       2  方法
       2.1  甘草水处理方法  甘草采用淋润结合，即用清水喷淋药材［11］。将药材整齐堆放，用清水均匀喷淋后以洁净湿润毛巾遮盖，喷淋的次数根据不同样品质地而异，一般为2～3次/d，使药材外部的水分渗透到组织内部，达到内外湿度一致，以适合切制，切后及时干燥。
       2.2  甘草苷测定
       2.2.1  色谱条件  色谱柱DIKMA DiamonsilR-C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） ；流动相为乙腈-0.5%冰醋酸（1∶4）；柱温 25℃；检测波长为 276 nm；按甘草苷峰计算理论塔板数＞4 000；流速为1.0 ml· min﹣1。
       2.2.2  线性关系和方法学考察  以甘草苷对照品制备标准曲线，以峰面积为纵坐标,对照品的含量(μg)为横坐标,得线性回归方程y = 1 598.4x - 2.638 5，r=0.999 9，线性范围：0.032 83～1.050 56 μg。以甘肃金塔3年生栽培甘草（未润）进行方法学考察，12 h内稳定，RSD=0.16%（n=6），重现性RSD=0.84%（n=6），精密度RSD=0.53%（n=6），加样回收率平均为97.9%,RSD=1.6%（n=6）。
       2.2.3  供试液制备  取0.3 g甘草粉末,精密称定,加60%乙醇25 ml,称重, （250 W，20 kHz）超声提取30 min,称重,补足损失重量,过滤,收集续滤液, 取上述样品溶液0.8 ml，用20%乙腈稀释定容至10 ml，过微孔滤膜。对照品和样品HPLC色谱图见图1。
       2.3  甘草酸测定
       2.3.1  色谱条件  色谱柱-DIKMA DiamonsilRC18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈1%冰醋 酸（42∶58）；柱温25℃；检测波长为250 nm；按甘草酸峰计算理论塔板数＞4000；流速为1.0 ml · min﹣1。
       2.3.2  线性关系和方法学考察  以甘草酸对照品制备标准曲线，以峰面积为纵坐标,对照品的含量(μg)为横坐标,得线性回归方程y = 781.61x - 15.517，r=0.999 9，线性范围：0.110 6～3.539 2 μg。以甘肃金塔3年生栽培甘草（未润）进行方法学考察，24 h内稳定，RSD=0.46%（n=6），重现性RSD=0.39%（n=6），精密度RSD=1.38%（n=6），加样回收率平均为98.4%,RSD=2.08%（n=6）。
       2.3.3  供试液制备  取0.3 g甘草粉末,精密称定,加0.3%氨水50 ml，称重, （250W，20 kHz）超声提取30 min,称重,补足损失重量,过滤,收集续滤液,过微孔滤膜。对照品和样品HPLC色谱图见图2。
       图1  甘草苷对照品（左）和样品（右）HPLC图（略）
       图2  甘草酸对照品（左）和样品（右）HPLC图（略）
       2.4   多糖含量的测定
       2.4.1  甘草多糖的制备  称取粉碎的样品120 g,经石油醚（60～90℃）500 ml回流提取2次，1 h/次；再用80%乙醇500 ml回流提取2次，2 h/次；残渣在水浴上锅上挥干溶剂，用600 ml水回流提取3次，2 h/次；合并提取液，1%活性碳30℃磁力搅拌脱色30 min，过滤；减压浓缩滤液至300 ml；Sevag法除蛋白∶氯仿 ∶正丁醇（4 ∶1）多次萃取，除蛋白；萃取液加95%乙醇（5倍量左右）静置过夜，抽滤析出多糖，先后用无水乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤，60℃真空干燥即得。利用制备得到的甘草多糖计算出换算系数为2.479 586。
       2.4.2  线性关系和方法学考察  以D(+)Glucose对照品制备标准曲线以吸收度A为纵坐标,对照品的浓度C(mg/ml)为横坐标,得线性回归方程y = 64.238x + 0.008 8 r=0.999 7，线性关系范围10.08～ 80.64 μg·ml-1。以甘肃金塔3年生栽培甘草（未润）进行方法学考察重现性RSD=1.4%（n=5），加样回收率平均98.7%，RSD=0.996%（n=5）。显色0.5 h内稳定。
       2.4.3  样品测定  精密称取干燥样品粉末5份，每份300.00 mg，置于250 ml圆底烧瓶中，加入100 ml80%乙醇溶液，（250 W，20 kHz）超声1h去除杂质；过滤，80%乙醇洗至无色，挥干溶剂加100 ml蒸馏水回流2 h；过滤，完全转移至250 ml容量瓶，冷却后定溶备用。精密量取供试品溶液1 ml于20 ml刻度试管中，依次加入1 ml蒸馏水、1 ml 50 g/L苯酚溶液、5 ml浓硫酸；混匀，沸水浴15 min，冷却，以不加样为空白使用紫外分光光度法在λ487 nm处测定吸收度。
       2.5  黄酮含量的测定
       2.5.1  线性关系和方法学考察  以甘草苷对照品制备标准曲线以吸收度A为纵坐标,对照品的浓度C(mg/ml)为横坐标,得线性回归方程：y = 66.753x - 0.017 8,r=0.999 9,线性范围为18.76～112.56 μg。以甘肃金塔3年生栽培甘草（未润）进行方法学考察重现性RSD=1.9%（n=5），加样回收率平均为98.7%,RSD=2.0%（n=5）。显色0.5 h内稳定。
       2.5.2   样品测定  取0.1 g甘草粉末,精密称定,加甲醇50 ml，称重, （250W，20 kHz）超声提取80 min,称重,补足损失重量,过滤,收集续滤液, 取上述样品溶液0.5 ml,加入0.5 ml甲醇,再加入10%KOH溶液0.5 ml,室温放置5 min,用甲醇稀释定容至10 ml。以不加样为空白，使用紫外分光光度法在波长334 nm处测定吸收度。
       3  结果
       
       实验对5份样品润制前和润制后的4种成分进行了含量测定。结果见表1。
       表1  样品4种成分含量测定结果（略）
       通过对样品水处理前后多糖、甘草苷、甘草酸、黄酮4个成分测定结果分别使用SPSS10.0统计软件进行配对t检验，可知按α=0.05的水准，拒绝检验假设，水处理前后甘草4种成分含量均有显著差异。结果见表2。由均值变化可看出，水处理后多糖含量升高22.74%，甘草苷含量降低17.38%，甘草酸含量降低7.45%，黄酮含量降低9.49%。见图3（为了便于直观比较，多糖含量折算为原来1/5）的。
       表2  样品4种成分水处理前后T检验结果（略）
       图3  水处理前后4种活性成分含量变化示意图（略）
       4  讨论
       
       实验显示，水处理后的样品除多糖含量显著增高外，其余3个成分含量均显著降低，应当是由于润制的过程造成了成分的流失。而多糖在水中也有一定溶解度但润制后含量升高，分析原因可能有如下几点：水处理的过程在一定程度上促进了多糖的溶出，其幅度远大于润制过程中的成分流失；其他成分在水处理中溶于水而造成了质量减少，从而使多糖的相对含量升高；甘草中大量的皂苷成分有一定的助溶作用。其变化机制还有待进一步深入研究。
       
       饮片是直接供中医临床调配处方用的所有中药，饮片切制是中药炮制的重要工序。把药物切制成一定的规格，使药物有效成分易于溶出，并便于进行其他炮制，也利于干燥、贮藏和调剂时称量。干燥的药材切成饮片必须经水处理过程，目的是使药材吸收一定量的水分，使质地由硬变软，以便切制。但水处理过程必定会导致某些成分的含量不同程度的改变。目前应用到药材软化上的新技术有：真空加温润药技术、减压冷浸软化技术、加压冷浸软化技术［14］。都具有耗时短，用水量少，很大程度上防止了水处理过程中药材的腐化霉变和减少成分流失。建议根据不同需要决定是否对甘草进行水处理以及具体方法和技术。
       【参考文献】
         　　［1］ 季宇彬.甘草黄酮的研究进展［J］.中草药，2004,35(9)：附5.
       
       ［2］ 朱绪民,邸迎彤,彭树林,等,乌拉尔甘草中的化学成分［J］.中草药，2003,34(3)：199.
       
       ［3］ 汲晨锋,姜 薇,王晓晶.甘草多糖的化学与药理研究［J］.哈尔滨商业大学学报，2004,20(5)：515.
       
       ［4］ 刘 霞,谢建新,李 艳,等. 甘草多糖的超声提取及含量分析［J］.西北药学杂志，2004,19(2)：60.
       
       ［5］ 何三民,石森林. HPLC法测定甘草中甘草素、异甘草素、甘草苷的含量［J］.中草药,2003,34(7)：618.
       
       ［6］ 沈凤嘉,胡金峰,虞亚川,等.乌拉尔甘草化学成分的研究［J］.高等学校化学学报，1995,16(4)：572.
       
       ［7］ TanTianwei, HuoQing and LingQiang Purification of glycyrrhizin from Glycyrrhiza uralensis Fisch with ethanol/phosphate aqueous two phase system ，Biotechnology Letters［J］. 2002，24（17）：1417.
       
       ［8］ 唐小鹏.甘草不同水处理方法的比较研究［J］.湖南中医药导报，2002：8.
       
       ［9］ 聂锡明, 杲桂荣 .中药饮片切制的质量问题及处理［J］.山东中医杂志，1997 ,16(7 )：321.
       
       ［10］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ部 ［S］.北京：化学工业出版社, 2005：59.
       
       ［11］ 唐廷猷，蔡翠芳.现代中药炮制技术［M］.北京：化学工业出版社，2004：40.
       
       ［12］ 梁新松. 甘草最佳软化方法探讨［J］.时珍国医国药，2001 ,12 (4)：322.
       
       ［13］ 陈惠玲, 王建科, 张丽丽,等. 粗毛淫羊藿及其不同炮制品中总黄酮的含量［J］.中国中药杂志，2000,25(4)：239.
       
       ［14］ 张爱华,文红梅,彭国平,等.甘草生品、炙品黄酮含量比较［J］.中药材,1999,22(1)：21.