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       【摘要】 
       目的绞股蓝为名贵药食两用中药，品种多性状相似易混。用同功酶谱从生化水平建立起生产上推广的绞股蓝种质档案，为其新品种选育和提纯复状提供种质鉴别依据。方法采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究绞股蓝的同功酶谱。结果恩五叶蜜，恩七叶甜，绞股蓝，原变种，八叶自然株系的酶带数依次为9，9，9，10；酶带颜色依次为4深5浅，2深7浅，3深6浅，2深8浅；酶带宽度依次为6.00～8.56 nm，4.87～6.61 mm，6.01～6.84 mm，4.87～6.61 mm；酶带Rf值依次为0.14～0.90，0.16～0.93，0.14～0.76，0.07～0.89。结论研究发现，它们的同功酶有较大差异，从生化分子水平证明它们是不同的品种，可作为绞股蓝种质鉴别依据。
       【关键词】  不同品种绞股蓝； 过氧化氢同功酶
       绞股蓝Gynostemma pentapHyllum(Thunb.) makino系葫芦科多年生攀援草质藤本植物，为名贵的药食两用中药。其含有多种皂苷、氨基酸、多糖、微量元素、磷脂和黄酮类等化合物，而且有4种绞股蓝皂苷与人参皂苷的结构相同，有16种绞股蓝皂苷经水解后得到人参皂苷K，被誉为“第二人参”。具有抗疲劳、抗衰老、抗乏氧功效，长期应用能增强人体免疫力，同时有显著的镇静、催眠、抗疲劳、降血脂、保肝护心及治疗偏头痛功效，能调整机体的新陈代谢、延长细胞寿命、增强记忆力、增强免疫功能，防止正常细胞癌化，使癌细胞恢复正常，对肝癌、子宫癌、肺癌等癌细胞增殖的抑制有效果，适用于二十多种癌症，绞股蓝皂苷已开发为国家二级新药，是我国发改委认证的高新技术出口产品［1～3］，其多糖在临床上也有重大发现，用其也开发了许多产品。目前我国生产上使用的绞股蓝品种有恩五叶蜜、恩七叶甜绞股蓝、绞股蓝原变种3个品种。为了用生化手段准确鉴别其品种［4，5］和八种叶自然株系，对其进行了过氧化氢酶研究。
        1  器材与方法
        1.1  材料绞股蓝原变种和“恩五叶蜜”均采于湖北民族学院生物园。“恩七叶甜”、八叶自然株系采于湖北洲恩施州咸丰县武陵生物科技有限责任公司。
        1.2  仪器AL-204型电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；PHSJ-4A型实验PH计（上海精密科学仪器有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；TGL-L6G-A型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；V16-夹心式垂直电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；DYY-8C型电泳仪（北京市六一仪器厂）；STS-2型脱色摇床（上海琪特分析仪）；BLD-268RSD冰箱（河南新飞电器有限公司）；DL-1型电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）；KQ5200B型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司）；GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；HH-4型数显恒温水浴锅（金坛市小阳电子仪器厂）；YZYE-QI移液枪50ul（上海求精生化仪器）；镀铬游标卡尺（武汉教学仪器厂）；微量注射器（100μl）。
        1.3  试剂A液（1.5 mol/L三羟基甲基氨基甲烷盐酸 Tris-HCl，pH8.8分离胶缓冲液）：称取18.15 g Tris，用60 ml双蒸水溶解，再用4 mol/L盐酸调节至pH8.8，然后定容至100 ml，4℃保存。
        B液（丙烯酰胺凝胶贮备液）：取30 g丙烯酰胺（Arc）和0.8 g双丙烯酰胺（Bis）溶于双蒸水中，并定容至100 ml，待完全溶解后用滤纸过滤，4℃下避光贮存备用，可保存1～2个月。
        C液（10%SDS溶液）：称取10 g十二烷基硫酸钠（SDS）溶于80 ml双蒸水中，并轻缓搅拌（室温低时需水浴溶解），再定容至100 ml，室温存放。
        D液（10%TEMED）：量取100 μl（N，N，N"，N"）-四甲基乙二铵（TEMED），加双蒸水定容至1 ml。
        E液（10%过硫酸铵）：称取过硫酸铵0.1 g，溶于1 ml双蒸水中，用前配制。
        F液（0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8浓缩胶缓冲液）：称取6.06 g Tris，用60 ml双蒸水溶解，再用4mol/L盐酸调节至pH6.8，然后定容至100 ml，4℃保存。
        样品缓冲液（样品溶解液）：称取0.303 g三羟甲基氨基甲烷，分别取0.189 ml盐酸，4 ml甘油，0.8 g溴酚蓝，0.2 ml巯基乙醇，0.1%（质量浓度）溴酚蓝0.2 ml，再取双蒸水使之总体积10ml，4℃保存。
        电极缓冲液：称取3.0 g三羟甲基氨基甲烷，14.4 g甘氨酸，1.0 g十二烷基硫酸钠，用水溶解后，定容至1000 ml，pH8.3，不必调节。
        染色液：取1.0 g考马斯亮蓝R250，溶于250 ml甲醇及50 ml冰醋酸中，溶解后定容至500 ml。
        脱色液：100 ml甲醇（或乙醇）和100 ml冰醋酸混匀后，定容至1000 ml。
        2  方法
        2.1  装电泳槽取夹心的垂直电泳槽，用双蒸水将电极槽和玻璃片洗净并需将玻璃片烘干，冷却后嵌入胶带凹槽中。在长玻璃片下端与胶带保持2～3 mm的距离，使此端的凝胶与一侧的电极槽相通。为避免制胶时胶液由此狭缝漏掉，需先用电极缓冲液配制的1%琼脂糖封住，赶去气泡放平，夹上两边电极槽旋紧，并在这边灌上水，检查有无漏水。如水通过狭缝渗入凝胶模夹里，则须重新准备。
        将凝胶模板取出，将模板的两块长短不等的玻璃片取出用双重蒸馏水洗净、晾干，嵌入模子的硅胶框的凹槽中，将玻璃板嵌入凹槽中，长玻璃片下沿与硅框底之间保持2～3mm的距离，以便使下端的凝胶与一侧的电极槽相通，而短玻璃板的下端完全插入硅胶框底的槽内。
        把装好玻璃板的凝胶模子装入两个半槽之间，并主要将较短的玻璃板对着有铭牌的半槽，即向着连有负极的半槽，然后用螺丝将两个半槽固定在一起。在上螺丝时，要按一定的顺序逐个拧紧，均匀用力，切勿将玻璃板压碎，或造成漏液。
        2.2  琼脂封口称取0.2 g琼脂，加入10 ml电极缓冲液或双蒸水中，加热煮沸至没有沉淀，然后立即用10 ml移液管吸取5 ml左右琼脂液注入倾斜30°的长玻璃板外侧的下口处，使其沿夹板下部的夹缝中凝结成0.5 cm高的琼脂层，并冷却2    min至其凝固。
        2.3  制胶、灌胶按表1配制分离胶和浓缩胶。将配好的已抽气的凝胶（分离胶）沿玻璃板的内侧缓缓倒入，小心不要产生气泡，将分离胶液加到距玻璃板上沿约4～5 cm处为止，轻轻在胶面上加一层约0.5 cm厚的双蒸水层，作水封。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。加水时，注意不要扰动凝胶液面，避免产生气泡，保证凝胶能正常聚合。室温下静置约40 min，当水封层与凝胶面之间出现非常明显的界面时，即表示凝胶已聚合完全。然后，配备浓缩胶，之后用装有针头的注射器将水层吸掉，并用滤纸吸干多余的液体。接着沿长玻璃板内侧加入已抽气的浓缩胶，当浓缩胶液加到距短玻璃板上沿1 cm处为止，然后把梳状样品模板插入胶层顶部，样品梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。约60 min凝胶聚合成相互隔开的点样凹槽［8，9］。表1  分离胶和浓缩胶配方
        2.4  制样在凝胶聚合的60 min期间，制作绞股蓝样品液。制样前，先打开高速冷冻离心机，待机指示灯亮。设相关参数为SPEED：10000RPM，TIME：15 min，TEMP：4℃，ACC/DEC：4。设置好后，启动离心机，开始降温。然后，先将研钵置于冰块上降温，再分别称取绞股蓝的原种、“恩五叶蜜”“恩七叶甜”的嫩叶0.5 g放入研钵，同时加入一定量的提取缓冲液（加0.5 ml为宜，即按1∶1的比例提取样品液），迅速在冰浴中研磨成泥状。再将样品倒入离心管，与另一装有双蒸水的离心管置于托盘天平上平衡后，对称放入已降温至所需温度的离心机。离心后，将上清液倒入另外一个可以密封的试管中，置于冰箱中4℃保存［6，7］。
        2.5  点样夹好两个出水胶管，取下梳状样品槽模板，注意取样梳要快，以免破坏胶版。然后分别用微量注射器（50 μl）取20 μl样品液缓缓注入电样凹槽的底部，每个凹槽均要注入样品液。不可过低,以防刺破胶体,也不可过高。在样下沉时会发生扩散。为避免用微量注射器距槽底1/3处进样,加样前,样品在沸水中加热3 min，去掉亚稳态聚合。最好选用中部的孔注样，以免产生注射器边缘效应。在上槽注入电极缓冲液，直到盖过短玻璃板，淹没点样凹槽为止。再在下槽注入电极缓冲液，直到淹没金属丝为止。
        2.6  电泳将电泳槽置于冰箱中4℃条件下，上槽接负极，下槽接正极，打开电源，恒流15 mA，电压没要求，可调至200 V，时间定为2～3 h，即可开始电泳。1 h左右，待样品从浓缩胶进入分离胶后，将电流调节至20～30 mA，时间可定为5～6 h，之后整个电泳过程电流维持不变。当指示染料溴酚蓝迁移至距下沿1 cm左右，即可停止电泳。电泳结束后，关掉电源，将电极缓冲液再回倒入瓶中，上槽和下槽分开装并储存于4℃冰箱中，备下次实验用。
        2.7  染色从电泳槽中取下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器吸满蒸馏水，将针头插入凝胶与玻璃板之间，沿玻璃板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注入，最后注入少量空气，取出针头，将两玻璃板轻轻揭开即可取出凝胶板，将之置于培养皿中（可将浓缩胶层和琼脂层除去，只留分离胶层），用双蒸水冲洗胶面后，加入染色液淹没凝胶板，染色1～2 h，或过夜［10］。
        2.8  脱色染色结束后，倒出染色液，冲洗干净，加入脱色液，置于脱色摇床上脱色，并换脱色液7～8次，直至凝胶的蓝色背景退尽，酶带清晰为止。为保证效果，脱色时间一般不少于4 h［11］。
        2.9  干胶为永久性记录，可以对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。干燥的方法：先将脱色完毕的胶浸泡在30%（体积分数）甲醇及10%（体积分数）甘油溶液中，约15～30 min。
        3  结果
        3.1  绞股蓝过氧化物酶同功酶电泳电泳图谱见图1。
        3.2  酶带数目分析结果见表2。
        从酶带的数目看，恩五叶蜜、恩七叶甜和绞股蓝原种酶带数目一样多，具有P1～P9共9条酶带，而八叶自然株系有P1～P10共10条酶带。可见八叶自然株系在酶的种类上要占明显优势，且他们之间存在一定的差异。
        1.恩五叶蜜  2.八叶自然株系  3.恩七叶甜  4.绞股蓝原品
        图1  绞股蓝过氧化物酶同功酶电泳图谱
        表2  酶带数目
        品种酶带数目恩五叶蜜9八叶自然株系10恩七叶甜9原变种9
        3.3  酶带的颜色分析结果见表3。
        表3  酶带颜色
        品种P1P2P3P4P5P6P7P8P9P10恩五叶蜜深浅深浅深深浅浅浅-八叶自然株系深浅浅浅浅浅深浅浅浅恩七叶甜深浅浅浅浅深浅浅浅-原变种深浅深浅浅浅浅深浅-
        从酶带的颜色看，恩五叶蜜有4条为深色、5条浅色；恩七叶甜有2条为深色、7条浅色；八叶自然株系有2条为深色、8条浅色；原变种有3条呈深色、6条浅色，说明几个品种间有些相同酶的含量不同。
        3.4  酶带的宽度分析结果见表4。表4  酶带宽度
        恩五叶蜜酶带宽度从6.00 mm到8.56 mm，八叶自然株系酶带宽度从4.87 mm到6.61 mm，恩七叶甜酶带宽度从4.87 mm到6.61 mm，原变种酶带的宽度从6.01 mm到6.84 mm。由此可见恩五叶蜜酶带宽度范围要广，最宽达8.56  mm；而恩七叶甜酶带宽度范围就很窄，集中在5.40 mm左右，最宽也只有6.61 mm。可见，几种绞股蓝在同种酶的丰富度（即结构的多样性上）存在较大差异。
        3.5  酶带的相对迁移率Rf分析结果见表5。
        恩五叶蜜的Rf值为0.14～0.90,八叶自然株系的Rf值为0.07～0.89,恩七叶甜的Rf值为0.16～0.93，原变种的Rf值为0.14～0.76，说明它们有一定的遗传差异。表5  相对迁移率Rf
           4  讨论
        4.1  同功酶谱研究证明它们为不同的品种、株系绞股蓝原变种、恩五叶蜜、恩七叶甜和八叶自然株系各自的酶带数目分别是9、9、9、10，虽然前三者酶带数目相同但它们的Rf值是不同的，且它们的酶带颜色深浅、宽度和位点各不相同，且共有酶的含量，活性强度也不尽相同，说明它们各属于独立的物种，但它们之间存在着既独立有相互关联、亲疏远近距离各不相同的一种非常复杂的种间遗传关系，同时也表明绞股蓝的遗传多样性是丰富的，而这种复杂的遗传关系和丰富的遗传多样性可能是绞股蓝特别能适应温带地区的生态环境，而且能够长期、稳定和持续存在的主要原因之一。同时，这种复杂多样的遗传基因为我们未来的遗传育种研究以及绞股蓝的开发利用提供了非常丰厚的有价值的基因资源。研究出来的酶谱为生产提供了生化水平级的物种鉴别技术，确保品种不混杂，丰富了绞股蓝物种基因库。
        4.2  同功酶谱可从生化水平鉴别不同绞股蓝品种，为提纯复壮服务在长期的种植过程中和不利的生态环境条件下绞股蓝种性会发生变异导致所含成分发生变化，造成生产绞股蓝的原料和加工产品不被市场接纳。本研究的四个品种的酶谱可以随时监测生产使用的绞股蓝品种是否发生了退化变异，还可为绞股蓝生长提供最佳生态环境。
        4.3  同功酶谱可为绞股蓝品种间亲缘关系分类和杂交选择亲本提供相应服务目前，国内外在绞股蓝生产上使用鉴定品种有绞股蓝原变种、恩七叶甜、恩五叶蜜、日本冲绳201。如果要杂交育种，这4个品种就是当然的亲本。可以在本研究基础上进一步研究出他们品种间亲缘关系，为绞股蓝育种服务。
        4.4  选择好实验材料有进一步研究的必要植物的同功酶的表现，有着组织器官的特异性及发育阶段的特异性，这对利用过氧化氢酶进行品种鉴定和分类是一个不利因素，但它也存在着相对的稳定时期和适宜的采样部位，这使得其应用具备了可行性和科学性。不同品种存在着各自的特定酶谱，同类的品种其酶谱具有较稳定的相似性，说明用过氧化氢酶作为绞股蓝品种的鉴别和分类依据之一是有一定的价值。但是，环境条件及电泳过程许多因素的影响使酶谱表现出假多型性，故要用同功酶体现品种间的亲缘关系时，必须有适宜的取样时期、取样地点和取样部位，并尽可能增加重复次数，才更具有科学性。实验中由于时间的问题没有针对绞股蓝不同的组织、老嫩不一的叶片、不同的时间进行分别研究。另外在制胶过程中点的高分子和低分子蛋白标准品，但由于药品供应商给我们提供的蛋白标准品有质量问题，不能跑出蛋白酶谱，所以本文没有做酶谱分子量的估算［12～14］。
        4.5  影响制胶的因素及注意点制合格的胶是保证电泳成功的首要条件。琼脂封口时，封口高度在0.5～1 cm之间，小于0.5 cm，封口不牢，以致分离胶凝固后两边会出现狭缝，而无法水封，使实验无法进行。若大于1 cm，琼脂层就显得厚了，使电泳时间延长。另外，吸掉水封层后，应立即加入浓缩胶，即配好浓缩胶后再吸干水封层。以0.5 cm为宜，不可加得太多，以免减小分离层的厚度和减少其所含水分，使电泳效果受到影响。样品梳插入浓缩胶中不可太深，以免拉出时把样品槽的壁拉裂，从而影响跑胶的效果。
        处理电泳样品液及点样的技术是跑好酶谱的关键技术之一。样品在加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3 min，这是为了使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构。SDS与蛋白质结合使蛋白质-SDS复合物带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这是各种蛋白质分子本身的电荷上完全被SDS掩盖，这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常所加的溴酚蓝染料，是用于控制电泳过程的。另外样品处理液中所加的一定量的甘油或蔗糖，是为了增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。样品处理液中加有巯基乙醇，是作为蛋白质、酶的保护剂，一些蛋白质和酶的表面或内部含有半胱氨基酸巯基，易被空气中的氧缓慢氧化为磺酸或二硫化物而变化，保存时就加巯基乙醇［15］。
        电泳的过程中对电流的控制也是很重要。电泳的时间一般为6 h左右，电泳之前，在凝胶分界线处作一记号，且距底面1cm处即停止电泳。若时间长了，一些酶带就电泳到电极缓冲液里去了，致使一些酶带不能在凝胶上显示，得出的酶谱就不合格，不能正确反映样品的酶谱情况［16，17］。
        跑胶容易出现的问题及解决的办法。如纹理和拖尾现象，是由于样品溶解不好引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。电泳时间长，其原因是凝胶缓冲系统和电级缓冲系统的pH选择错误，即缓冲系统的pH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高 。指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好，导致分子有不同的迁移率所致。指示剂成皱眉符号（指示剂前沿呈现向下的曲线形），由于电泳槽的装置不合适，尤其是凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚和不完全。凝胶时间不对，通常胶是在30 min～1 h内凝好的。如果凝得太慢，可能是TEMED，AP剂量不够或者失效。AP应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝得太快，可能是AP和TEMED用量过多，此时的胶太硬易断裂。这些都是常见的几个问题和需解决的方法［18］。
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