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反相高效液相色谱法测定薄芝菌丝体中 3种核苷类成分的含量
作者:任爱农, 居明乔    
作者单位:江苏省中医药研究院,江苏 南京

《时珍国医国药》 2008年 第10期

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       【摘要】 
       目的建立高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法同时测定薄芝菌丝体中3种核苷类成分(尿嘧啶、尿苷、腺苷)的含量。方法采用RP-HPLC法测定,Alltima C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)为色谱柱,流动相为乙腈-水,梯度洗脱(0~15 min,乙腈-水比例为5∶995,15~30 min,比例为15∶985),流速1.0 ml·min-1,检测波长262 nm。结果3个核苷的线性范围分别为,尿嘧啶:0.140 2 ~0.700 8 μg, (r=0.999 8,n=5);尿苷:0.103 2~0.515 6μg(r=0.999 7,n=5);腺苷:0.124 5~0.622 4 μg(r=0.999 4,n=5)。平均加样回收率分别为:尿嘧啶99.44%,尿苷100.08%,腺苷99.96%。结论该方法灵敏度高、操作简便、重复性好、效率高,为全面评价薄芝菌丝体质量提供一个可靠方法。
       【关键词】  反相高效液相色谱法; 薄芝菌丝体; 梯度洗脱; 核苷类成分
       Determination of Nucleosides in Bo Zhi Mycelium by RPHPLC
        REN Ainong,    JU Mingqiao
        (Jiangsu  Provincial  Institute  of  Traditional  Chinese  Medicine, Nanjing 210028,China)
        Abstract:ObjectiveTo determine the contents  of nucleosides in Bo Zhi Mycelium(uracil, uridine, adenosine) by HPLC with gradient elution.MethodsUracil, uridine, adenosine were dealt with by HPLC with  Alltima- C18 analytical column (5μm,250 mm×4.6 mm). The mobile  plase  consisted of acetonitrile-water,gradient elution(0~15 min,CH3CN-water 5:995,15~30 min, CH3CN-water 15:985). The flow rate was 1.0 ml·min-1.The UV  detection  was  set  at 260 nm.ResultsThe linear ranges of uracil, uridine and adenosine were 0.140 2 ~0.700 8 μg (r=0.999 8,n=5); 0.103 2~0.515 6 μg (r=0.999 7,n=5); 0.124 5~0.622 4μg (r=0.999 4,n=5) respectively.The average recovery was 99.44%; 100.08% and 99.96% respectively.ConclusionThis method is simple,reliable,efficient,and provides a reference standard for the quality control of Bo Zhi Mycelium.
        Key words:RH-HPLC;   Bo Zhi Mycelium;   Nucleosides;   Gradient elution
        薄芝菌丝体为多孔菌科灵芝属薄盖灵芝Ganoderma capense(Lloyd.)Tend.菌经深层培养所得的菌丝体。市场上有用薄盖灵芝菌丝体为原料制成的薄芝片和注射液,临床上主要用于硬皮病、皮肌炎、多发性肌炎、红斑狼疮、斑秃、银屑病、进行性肌营养不良、妇女更年期综合征、神经衰弱等病症治疗。对所含有效成分的含量测定研究,文献报道虽有尿苷作为原料菌丝体含量测定报道[1],但未见多种成分的测定报道,鉴于中药多组份多靶点的作用特点,本实验采用HPLC法对其原料菌丝体所含功效成分腺苷、尿嘧啶、尿苷3种成分在同一条件下进行了含量测定研究。
           1  仪器与试药
        1.1  仪器高效液相色谱仪(美国S﹒S﹒I Series Ⅲ 泵,检测器  美国S﹒S﹒I  Model 500);Alltima C18柱(5μm,4.6 mm×250 mm);千谱数据处理系统。
        1.2  试药腺苷对照品(美国 Sigma公司,含量99%,批号 1093813);尿嘧啶对照品(美国 Sigma公司,含量99%,批号1083813);尿苷对照品(中国药品生物制品检定所,供含量测定用,批号887-200001);溶剂均为分析纯和色谱纯,超纯水。
        1.3  药材薄芝菌丝体由南京中医药大学生药鉴定教研室刘训红教授鉴定。
        2  方法与结果
        2.1  溶液的制备
        2.1.1   对照品溶液的制备 精密称取80℃干燥至恒重的对照品:尿嘧啶4.38 mg,尿苷3.23 mg,腺苷3.89 mg,称定,分别置25 ml量瓶中,加水适量使溶解并稀释至刻度。吸取各对照品储备液1,2,3,4,5 ml于25 ml量瓶中,混合,加水稀释至刻度,摇匀,依次作为1,2,3,4和5号混合对照品溶液。
        2.1.2  供试品溶液的制备  取本品细粉1 g,精密称定,精密加入水50 ml,称定重量,超声处理1 h,放冷,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液25 ml,蒸干,残渣加2 ml水溶解,拌入硅胶0.5 g,置硅胶小柱(100~200目,10 g内径1.5~2.0 cm,湿法装柱)上,用丙酮-乙醇(3∶1)100 ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加水定容至25 ml,摇匀,过滤,取续滤液用0.45 μm微孔滤膜过滤,即得。
        2.1.3  专属性实验  用流动相及空白溶剂进样,结果表明系统无污染,阴性对照对检测结果无干扰。用供试品溶液及混合对照品溶液进样,单一成分的色谱峰保留时间与供试品对应成分的色谱峰保留时间相比较彼此吻合,表明方法专属性良好。见图1。理论塔板数按尿苷峰计算不低于4 000。
        2.2   色谱条件  色谱柱为 Alltima C18柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流动相为乙腈-水,梯度洗脱(0-15min, 乙腈-水比例为5∶995,15~40 min,比例为15: 985); 流速为1.0 ml/min;检测波长262 nm;柱温25℃;进样量20 μl(定量环)。在上述色谱条件下,对照品、样品和阴性对照样品的色谱图见图1。
        a-对照品  b-样品  c-阴性对照品  1.尿嘧啶  2.尿苷  3.腺苷
        图1  薄芝菌丝体HPLC色谱图
        2.3  线性关系的考察  依次精密吸取上述1~5号混合对照品溶液各20 μl进样,按色谱条件测定峰面积,以峰面积为纵坐标,以对照品进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线,尿嘧啶、尿苷、腺苷的线性回归方程分别为:
        Y =2 550 596.46 X +4 005  r=0.999 8 
        Y=5 574 605.07X+ 6 115.78  r=0.999 7
        Y=9 915 070.28X-346 289.7  r=0.999 4
        线性范围分别为0.140 2 ~0.700 8 μg,0.103 2~0.515 6 μg,0.124 5~0.622 4 μg。
        2.4  精密度实验  精密吸取线性关系项下3号混合对照品溶液,重复进样6次,结果平均峰面积分别为:尿嘧啶1 063 910,RSD为1.10%; 尿苷1 720 815,RSD为1.75 %;腺苷1 701 831,RSD为1.46 %。
        2.5  重复性实验  取同一批号样品(060813)6份,分别照含量测定项下的方法操作,结果平均每克含尿嘧啶为0.90 mg,RSD为1.30%;尿苷为1.11 mg,RSD为1.06%;腺苷为1.32 mg,RSD为1.12%。
        2.6  稳定性实验  取含量测定项下的供试品溶液(样品批号060813), 在0, 4,8,12,24 h吸取上述溶液20 μl注入液相色谱仪,进行稳定性考察,结果平均峰面积分别为尿嘧啶:4 410 176,RSD为1.58%;尿苷:2 449 726,RSD为2.58%;腺苷:4 855 075,RSD为1.82 %。      
        2.7  加样回收率  分别取已知含量样品(批号060813)6份,按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法,取细粉约0.5 g,精密称定,分别精密定量加入对照品,制成加样供试品溶液;按上述色谱条件测定,计算加样回收率。结果见表1。表1  加样回收率实验结果
        2.8   样品含量测定  取3批样品, 分别按“2.1.2”项下的供试品溶液制备方法,制成供试品溶液;按上述色谱条件测定。结果见表2。表2  3批样品的含量测定结果
        3  讨论
        3.1  流动相选择 同时测定3种成分,单一体系的流动相很难将3种成分在短时间同时分开,本实验采用的梯度洗脱系统使3种成分得到满意分离。
        3.2  检测波长的选择  尿嘧啶、尿苷、腺苷在本实验流动相中的紫外光谱262 nm处,均有较强吸收,故选择262 nm为检测波长[2]。
        3.3   提取方法  本实验曾采用甲醇和水提取核苷类成分研究,结果表明水提取效率高于甲醇,故采用水提取;水提取后液相图谱显示,5 min前有杂质峰堆积,采用小柱洗脱,小注洗脱后,液相图谱显示色谱图清晰,回收率结果表明柱洗脱无吸附,提取完全,故采用小柱洗脱。
        本实验方法灵敏、准确、简单易行,可作为薄芝菌丝体的含量测定方法。
       【参考文献】
         [1] 任爱农 ,李 韵.薄芝菌丝体的质量标准研究[J].中南药学,2006,4(6):436.
       
       [2] 袁永生,张 莉,许效枫,等.反相高效液相法测定虫草菌粉中核苷类成分的含量[J].中国药学杂志,2002,37(10):776.

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