文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的研究不同型号大孔吸附树脂对鸡血藤总黄酮的吸附解吸性能,为分离纯化鸡血藤总黄酮提供选择树脂的依据，选择最佳提取分离工艺。方法以鸡血藤总黄酮含量为指标,考察4种不同型号大孔树脂对鸡血藤总黄酮的比吸附量和比洗脱量。结果通过吸附容量和洗脱效果的比较，FL2和DS401型号树脂对鸡血藤总黄酮的吸附容量大,易洗脱。结论4种不同型号大孔树脂对鸡血藤总黄酮的吸附及解吸性能有很大差异,综合其比吸附量和比洗脱量。FL2和DS401型号树脂较适合分离纯化鸡血藤总黄酮。
       【关键词】  鸡血藤； 总黄酮； 大孔吸附树脂
       鸡血藤为传统中药，性温，味苦、甘，归肝肾经，有补血活血，通络的功效［1］，用于月经不调,血虚萎黄，风湿痹痛等症。现代药理研究表明,鸡血藤具有抑制血小板聚集，抗心率失常［2］，刺激骨髓造血的功能［3］，临床上用其治疗贫血、各种原因引起的白细胞、血小板、红细胞等全血象减少和再生障碍性贫血等疾病。最新研究显示,鸡血藤富含黄酮类成分,具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、扩张血管、调节免疫等多种药理作用［4］。能通过阻断细胞周期和诱导细胞凋亡途径特异的抗肿瘤增殖,而对正常组织细胞毒性较小［5］。因此,揭示鸡血藤的抗肿瘤机制及活性部位将成为重中之重，是当前研究的热点。   
        鉴于大孔树脂在中药纯化、富集黄酮类化合物的广泛应用,本文将对4种性能不同的大孔树脂进行比较,选择出对鸡血藤总黄酮吸附、解吸都较好的型号,为分离纯化鸡血藤总黄酮提供快速、高效的途径。
        1  仪器与试剂
        1.1  仪器岛津紫外分光光度计（UV-2201）。
        1.2  药材 鸡血藤购于北京卫仁中药饮片厂(批号：603305101)，经鉴定为豆科植物密花豆的干燥藤茎。
        对照品大豆苷元 含量测定用 (购于中国药品生物制品鉴定所)； 染料木素含量测定用（购于sigma公司）；葛根素含量测定用（购于中国药品生物制品鉴定所)。
        大孔树脂DS-401；FL-2；D1400(天津市海光化工有限责任公司)；FL-1(天津欧瑞生物科技有限公司)。
        1.3  试剂  所用化学试剂均为分析纯  95%乙醇(AR)。
        2  方法与结果
        2.1  大孔吸附树脂预处理 各型树脂用 95%乙醇浸泡4 h后湿法上柱，95%乙醇流动清洗，并不时检查流出液，至流出乙醇液与水混合（1∶5）不呈白色混浊为止，然后用大量蒸馏水流动清洗，至无醇味备用。
        2.2  标准溶液的制备  精密称取大豆苷元标准品5 mg 80%乙醇溶解，超声20 min,充分溶解后定容至25 ml，作为对照品溶液备用。
        2.3  标准曲线的绘制精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 ml,分别置于7个10 ml干净容量瓶中，80%乙醇定容至10 ml,摇匀，紫外分光光度计278 nm处单波长测定，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程，A=59.125C+0.010 86，r=0.999 8(线性范围0.002～0.014  mg/ml)。见图1。
        图1  大豆苷元标准曲线图
        2.4  供试液的制备 取鸡血藤500 g，2 500 ml 80%乙醇浸泡过夜,加热回流提取3次，2 h/次，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，加入5 000 ml蒸馏水，稀释至每毫升含生药0.1 g的溶液，静至过夜，过滤，滤液作为供试品备用。
        2.5  总黄酮含量测定  采用紫外分光光度法，以大豆苷元为标准品，在278 nm处测定其吸光度，代入回归方程换算样品溶液的浓度，计算总黄酮含量。
        2.6  树脂的筛选与解析
        2.6.1  4种型号大孔吸附树脂对鸡血藤总黄酮的动态吸附性能考察各型号树脂比吸附量的测定 将预处理好的4种型号树脂适量（相当于5 g干树脂），分装到4个100 ml带塞具塞三角瓶中，精密加入供试液50 ml，室温下振摇吸附12 h。在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 h时吸取上清液，测定样品中总黄酮含量。按下式计算t小时内各树脂对鸡血藤总黄酮的比吸附量，以比吸附量对t作图，得到各树脂鸡血藤总黄酮吸附动力学曲线，见图2。 
        A=（C1吸附前-C2吸附后）×V1样/ W树脂
        式中A：比吸附量（mg/g）；C1：吸附前供试液浓度（mg/ml）；C2：吸附后上清液浓度（mg/ml）；V1：样品液体积ml；W：干树脂重量g。
        图2  4种不同型号大孔树脂对鸡血藤总黄酮吸附动力曲线
        2.6.2   4种型号大孔吸附树脂对鸡血藤总黄酮解析性能考察将充分吸附鸡血藤总黄酮的4种不同型号树脂分别用20%，30%，50%，70%，95%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中所含鸡血藤总黄酮含量，按下式计算比洗脱量。
        M=（C洗脱×V样品）/W树脂
        式中M：比洗脱量（mg/g）；C：洗脱液浓度(mg/ml)；V:样品液体积（ml）； W：干树脂重量（g）。得鸡血藤总黄酮不同浓度洗脱剂洗脱动力曲线见图3。
        2.7  生药浓度、药液用量、洗脱速度对大孔吸附树脂吸附解析的影响
        2.7.1  生药浓度对大孔吸附树脂吸附鸡血藤总黄酮的影响 分别制备0.5，1 ，2 g/ml 3个浓度样品液，精密量取50 ml,加入5 g FL-2型干树脂中静态吸附，每小时测定1次溶液中总黄酮的剩余量，计算出其比吸附量，结果见表1。
        2.7.2  药液用量对大孔吸附树脂吸附鸡血藤总黄酮的影响分别精密量取生药浓度1 g/ml的药液20，50，70 ml，加入5 g FL-2型干树脂中静态吸附，每小时测定一次溶液中总黄酮的剩余量，计算出其比吸附量，结果见表1。
        2.7.3  洗脱速度对大孔吸附树脂吸附鸡血藤总黄酮的影响分别精密量取3份药液浓度为1 g/ml的样品液50 ml于3个100 ml干净三角瓶中,加入5 g干树脂中，静态吸附6 h，充分吸附后用70%乙醇洗脱，收集洗脱液，按“2.6.2”项下测定计算洗脱液中鸡血藤总黄酮含量，结果见表1。 表1  生药浓度，药液用量，洗脱速度对大孔树脂吸附解析的影响
        3  讨论
        应用大孔树脂分离纯化鸡血藤总黄酮研究数据表明，4种树脂对鸡血藤总黄酮的吸附容量有明显差异，4种树脂中，FL-1型号树脂对鸡血藤总黄酮的吸附容量最大，D1400的吸附容量最小。DS-401，FL-2，FL-1 三种树脂6 h对鸡血藤总黄酮的比吸附量均超过12 mg/g,表明这3种树脂对鸡血藤总黄酮的吸附能力较强。同时，从图1还可以看出，这3种树脂对鸡血藤总黄酮吸附速度差异较大，FL-2型树脂在4 h时，率先达到饱和， DS-401，FL-1在5 h时相继达到饱和，D1400 12 h也未达到饱和（以12 mg/g为准）。因此，4种树脂对鸡血藤总黄酮的吸附速度顺序为：FL-2>FL-1>DS-401>D1400。
        (注：累积比洗脱量为各低浓度乙醇比洗脱量与本浓度乙醇比洗脱量的累加)
        图3  4种不同型号大孔吸附树脂累积比洗脱图
        由图2看出，4种树脂吸附鸡血藤总黄酮后，在20%～70%乙醇浓度区间内，随着洗脱剂乙醇浓度的增大，各树脂的比洗脱量也随之增大。乙醇浓度达到50%时，比洗脱量已明显改善，而70%更为完全，可达到总洗脱量的99%，与95%乙醇洗脱未见明显差异，因此选用70%乙醇作为洗脱溶剂。
        从比吸附量的测定结果看，4种型号树脂吸附鸡血藤总黄酮的能力顺序为：FL2＞FL1＞DS401＞D1400；从此洗脱量的测定结果看，4种型号树脂解析附的能力顺序为：FL2＞DS401＞D1400＞FL1。综合考虑选用型号为FL-2的大孔吸附树脂为纯化鸡血藤总黄酮的吸附剂，70%乙醇为洗脱剂。
        同时，我们还对影响树脂吸附解析得其他诸多因素作了相关的考察，如生药浓度，药液用量，洗脱速度等。结果显示，药液浓度越低，药液用量越少，样品吸附越完全，即生药浓度0.05 mg/ml，20 ml为最佳吸附药物浓度及用量。但从实验数据的结果来看，生药浓度0.1 mg/ml，50 ml的条件与最佳条件相比，差异并不显著，为提高大孔树脂与药液之间的效价比，最终选取生药浓度0.1 mg/ml 药液用量50 ml的药液作为样品液。洗脱速度因70%乙醇洗脱剂对药液解析能力较强，未能表现出显著性差异来，因此选用流速为 1.0 ml/min。
        为进一步考察大孔树脂类型对黄酮类成分保留的影响，我们对其50%，70%乙醇洗脱物与聚酰胺纯化物进行了比较，其主要成分类似。尤其与FL-2型大孔树脂50%，70%乙醇洗脱物较接近。
       【参考文献】
         ［1］ 国家药典委员会.中国药典［S］.北京：化学工业出版社， 2005：134.
       
       ［2］ 江 涛，唐春萍，李娟好，等.鸡血藤对大鼠主动脉环收缩反应的影响［J］.广东药学院学报，1996，12（1）：33.
       
       ［3］ 王东晓，陈孟莉，殷建芬，等.鸡血藤活性成分SS8对骨髓抑制小鼠造血祖细胞增殖的作用［J］.中国中药杂志，2003，28(2)：152.
       
       ［4］ 杨建英，张勇法，王艳玲，等．大豆异黄酮的测定方法［J］.化工时刊，2003，17(6)：48.
       
       ［5］ 唐 勇，何 薇，王玉芝，等. 鸡血藤黄酮类组分抗肿瘤活性研究［J］.中国实验方剂学杂志，2007，13（2）： 51.