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       【摘要】 
       目的研究黄连解毒汤中栀子苷在缺血性脑血管病模型大鼠体内的药动学规律。方法采用线拴法制造大鼠缺血性脑血管病模型，用HPLC法测定血浆中栀子苷浓度的经时变化，浓度-时间数据用3P97药代动力学软件进行分析，计算药动学参数。结果 缺血性脑血管病模型大鼠灌胃黄连解毒汤后，黄连解毒汤中栀子苷的药动学模型符合二室开放模型，其主要药动学参数分别为：t1/2α=（90.99±31.29 ）min，t1/2β=（1 054.08±148.42）min，t1/2Ka=（68.00±17.05） min，T(peak)= （166.97±83.75） min，Cmax =（10.19±8.52）μg/ml ，AUC=（8 642.81±3 086.92） μg·ml-1·min-1。结论明确黄连解毒汤中栀子苷在缺血性脑血管病大鼠体内的药动学特征，为临床合理用药提供一定的参考作用。
       【关键词】  黄连解毒汤； 栀子苷； 缺血性脑血管病； 药动学
        Study on the Pharmacokinetics of Jasminoidin in Huanglianjiedu Decoction in Rats with Ischemic Cerebrovascular Disease
        QIAO Xiaoli1,XIAO Xuefeng1*,   GAO Lan1,ZHANG Junping2, DU Wuxun3, LI Cunyu1
        (1.Tianjin University of TCM, Tianjin 300193, China; 2. First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 3. Second Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300150, China)
        Abstract：ObjectiveTo investigate the pharmacokinetic characters of jasminoidin in Huanglianjiedu Decoction in rats. Methods Focal cerebral ischemia was induced by occlusion of the middle cerebral artery(MCA) using the intraluminal filament technology, HPLC was used to determine jasminoidin level in biological samples, and the 3P97 software was used to analyze the plasma concentration-time data. ResultsAfter ig jasminoidin in rats with ischemic cerebrovascular disease, the plasma concentration-time course fitted well to two-compartment model and with the following pharmacokinetic parameters: t1/2α=(90.99±31.29)min, t1/2β=(1054.08±148.42)min, t1/2Ka=(68.00±17.05)min, T(peak)= (166.97±83.75)min, Cmax =(10.19±8.52)μg/ml , AUC=(8642.81±3086.92) μg·ml-1·min-1. ConclusionThe pharmacokinetic characteristics of jasminoidin is understood in rats with ischemic cerebrovascular disease, which will play a reference role in clinical application.
        Key words：Huanglianjiedu Decoction;  Jasminoidin;  Ischemic cerebrovascular disease;   Pharmacokinetics
        黄连解毒汤始载于《外台秘要》，由黄连、黄芩、黄柏、栀子4味药组成，具有抑菌、降压作用，为清热解毒的代表方。实验表明，黄连解毒汤具有一定的抗小鼠脑缺血缺氧的作用［1］，对家兔脑缺血缺氧有明显的保护作用［2］。其中栀子的主要成分是栀子苷（Jasminoidin），属于环烯醚萜苷类成分，具有抗病原体、抗炎、镇静镇痛、降温解热、利胆保肝作用［3］。现代药理研究表明，栀子苷对缺血性脑神经损伤中的自由基损伤具有很好的拮抗作用，对缺血性脑神经损伤具有一定的保护作用［4］。关于栀子苷在复方中含量测定的研究，有很多报道［5～7］。而对于生物样本中，特别是病理状态下生物样本中栀子苷的含量测定报道很少［8,9］。本文应用HPLC法测定了黄连解毒汤中的栀子苷在缺血性脑血管病大鼠模型体内的血药浓度，并进一步得到了黄连解毒汤中栀子苷的药代动力学参数，以期为临床用药提供一定的依据。
           1  器材
        1.1  仪器 Waters515系列高效液相色谱仪(515 HPLC pump，2487DualλAbsorbance Detecter)； LG10－2.4A型高速离心机（北京医用离心机厂）；N-EVAPTM111氮吹仪(Organomation Associates，Jnc。 266River Road West Berlin，MA01503.U.S.A.)；MettlerM 200十万分之一电子分析天平；XW－80A微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)。
        1.2  药品与试药 栀子苷对照品购于中国药品生物制品检定所，批号110749-200511。
        黄连、黄柏、黄芩、栀子均购自天津中新药业。乙腈为色谱纯，天津市协和昊鹏色谱科技有限公司；色谱分析用水为娃哈哈饮用纯净水。
        1.3  动物 SD大鼠12只，体重270 g左右，雄性，中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供，清洁级，合格证号：SCXK津2005-0001，灌胃前禁食12 h，自由饮水。
        2  方法
        2.1  样品制备 精密称取黄连9 g，黄芩6 g，黄柏6 g，栀子9 g，加8倍量水浸泡2 h，武火煮沸后文火煎煮40 min，取一煎液，再加6倍量水煎煮30 min后取二煎液，二液合并后浓缩成含生药2 g/ml备用。
        2.2  色谱条件 CenturySIL BDS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（12∶88），流速0.8 ml/min，检测波长236 nm，柱温为室温。
        2.3  缺血性脑血管病动物模型制作 参照Longe法，用10%水合氯醛（3.5 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠。颈部正中切口，手术显微镜下暴露左侧颈外动脉，沿颈外动脉依次分离其枕动脉、甲状腺上动脉分支，使用电刀凝闭。结扎颈外动脉远心端，使颈外动脉残端游离。在其残端起始部做楔形切口，由此插入钓鱼线（直径0.25  mm，头端呈直径约0.3 mm的圆形球），使之由颈外动脉通过分叉部进入颈内动脉，至大脑中动脉的起点，阻断大脑中动脉的血液供应。用缝合线扎闭颈外动脉残端，剪掉多余钓鱼线，逐层缝合颈部缺口。该模型成功的标志为大鼠苏醒后出现同侧Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫。
        2.4  血浆样品预处理 实验大鼠眼底取血至肝素化试管中，离心后得空白血浆。取空白血浆，加入甲醇液1 ml，再加入1 mol/L磷酸二氢钾溶液50 μl，于微型旋涡混合仪混合30 s，6 000 r/min离心，吸取上清液800 μl，45℃以下氮气吹干，以50 μl甲醇复溶，旋涡混匀，离心，取上清液20 μl进样。
        2.5   标准曲线的制备 分别配制含栀子苷浓度为1，5，15，20，25，40μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”项方法处理样品，在“2.2”项所述色谱条件下进样。以栀子苷峰面积（Y）对栀子苷浓度（C）作线性回归。栀子苷标准曲线回归方程为Y=12160C－19252（r=0.996 2）。结果表明血浆浓度在1～40 μg/ml范围内线性良好，最低定量限为1 μg/ml，RSD为8.88%。
        2.6  回收率 分别配制含栀子苷浓度为2，20，40 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”项方法处理样品，在“2.2”项所述色谱条件下进样。按照栀子苷测得量和投入量之比计算回收率。其低，中，高3个浓度的回收率分别为(87.50±1.21)%，RSD=1.38 %；(88.09±3.70)%，RSD 4.20 %；(87.26±2.50)%，RSD=2.86% (n=5)。
        2.7  精密度 分别配制含栀子苷浓度为2，20，40 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在“2.2”项所述色谱条件下进样。同一浓度每隔1 h测定1次，测3次，计算日内精密度；每隔1天测定1次，测3天，计算日间精密度。其低,中,高3个浓度的日内的RSD值分别为3.92%，3.14%，2.86%；日间的RSD值分别为3.63%，4.17%，2.94%(n=5)。
        2.8  提取回收率  分别配制含栀子苷浓度为2，20，40 μg/ml的系列血浆，按“血浆样品预处理”方法处理样品，在“2.2”项所述色谱条件下进样，记录栀子苷的峰面积。另取同样浓度的栀子苷对照品各5份于试管中，不加空白血浆，并加入甲醇液1 ml，再加入1 mol/L磷酸二氢钾溶液50 μl，于微型漩涡混合仪混合30 s，6 000 r/min离心，吸取上清液800 μl，45℃以下氮气吹干，以50 μl甲醇复溶，漩涡混匀，离心，取上清液在“2.2”项所述色谱条件下进样，记录栀子苷峰面积。计算以上二者峰面积比，即得提取回收率。其低，中，高3个浓度的提取回收率分别为(84.81±10.60)%，RSD12.50%；(87.53±5.42)%，RSD6.19%；(90.31±3.72)%，RSD4.12% (n=5)。
        2.9  药代动力学实验 大鼠12只，造模为缺血性脑血管病模型，随机分为6组，给药前禁食不禁水12 h，每组两只大鼠均按2 ml/100g的剂量灌胃给予黄连解毒汤，给药后于10，30，60，90，120，150，180，210，240，360，480，600，1 080 min分别眼底取血0.5 ml于肝素化试管，6 000 r/min离心15 min，取血浆100 μl，按“血浆样品预处理”方法处理样品，取上清液于“2.2”项所述色谱条件下进样。血浆经HPLC测定获得栀子苷峰面积，由标准曲线计算出栀子苷的血药浓度。血药浓度-时间数据采用3P97药动学软件分析，自动拟合房室模型，获得药动学参数。
           3  结果
        3.1  色谱分离 栀子苷对照品、空白血浆、空白血浆加栀子苷对照品和给药后血浆的色谱图见图1。血浆中的内源性成分不干扰栀子苷的检测。
        3.2  血浆中黄连解毒汤中栀子苷浓度经时变化 缺血性脑血管病大鼠灌服黄连解毒汤后，血浆栀子苷浓度随时间呈动态变化，其血药浓度-时间数据见表1，浓度-时间曲线见图2。
        3.3  黄连解毒汤中栀子苷药动学参数  结果见表2。表1  黄连解毒汤中栀子苷在缺血性另用3P97程序将药-时数据进行统计矩分析，得到非隔室模型药动学参数，结果见表3。表2  黄连解毒汤中栀子苷在缺血性脑血管病大鼠体内的药动学参数（隔室模型） 表3  黄连解毒汤中栀子苷在缺血性脑血管病 大鼠体内的药动学参数（非隔室模型）
        4  讨论
        由于栀子苷为环烯醚萜苷，极性较大，在醋酸乙酯中溶解性较小，因而提取回收率比较低，达不到实验的要求，故选用有机溶剂沉淀蛋白的方法。最终采用甲醇沉淀蛋白，N2吹干后甲醇复溶解的方法，提取回收率较高，获得较满意的效果。
        通过对大鼠血浆中栀子苷的测定方法考察，建立了测定大鼠血浆中栀子苷含量的HPLC法，该方法灵敏度高，专属性强，数据可靠，适用于生物样品测定的要求，为研究黄连解毒汤动物体内的药代动力学提供了可靠的方法。
        近年来对黄连解毒汤研究不断有新的拓展，药理研究表明：黄连解毒汤有改善脑缺血益智作用、对低氧性脑病的保护作用和降脂防动脉硬化等作用。有报道表明，黄连解毒汤治疗脑血管障碍患者的作用机制是使患者脑血流量增加，改善脑循环，与脑神经介质等的代谢激活作用有关，从而使自觉症状、意欲低下、情绪障碍等次要症状有显著改善，智能障碍等核心症状也有明显的改善。近年中日两国对黄连解毒汤煎剂及其提取物用于脑血管病的基础研究与临床报道较多，均提示黄连解毒汤在治疗缺血性脑血管病有良好前景。
        栀子苷的药理研究表明，它对缺血性脑神经损伤中的自由基损伤具有很好的拮抗作用，对缺血性脑神经损伤具有一定的保护作用，同时，栀子苷可阻抑脑缺血损伤后致炎因子TNF-α和IL-1β及血浆vWF的表达，显示出其抗缺血后血管内皮细胞损伤、在炎症病理环节阻抑脑缺血损伤级联反应的作用。
        进一步的实验证明，栀子苷治疗脑缺血的重要机制之一，可能是栀子苷降低缺血后脑组织 MCP－1的含量，进而减少小胶质细胞活化和单核巨噬细胞在损伤部位积聚等有关。黄芩苷、栀子苷对缺氧缺糖/再灌注损伤的神经细胞有保护作用［10～12］。
        众所周知，药物的体内过程可能会受到病理状态的影响，对于临床应用而言，病理状态下获得的药动学参数甚至更有意义，故研究病理状态下药动学参数的改变是必要的。缺血性脑血管病是临床常见的一种病理过程，本实验中，我们选择缺血性脑血管病模型，探讨了黄连解毒汤的有效成分之一栀子苷在缺血性脑血管病状态下的体内动力学过程，为黄连解毒汤临床用药方案的确定提供依据，为揭示黄连解毒汤作用机制的研究提供新思路。
       【参考文献】
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