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       【摘要】 
       目的筛选具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的蛇足石杉内生真菌菌株。方法采用DTNB显色法，优化条件后筛选；对蛇足石杉的29株内生真菌菌株发酵液醇提物进行了酶抑制活性的初步筛选。结果xg，g8，g5，xgc2，xy7对乙酰胆碱酯酶具有较高的抑制率，其IC50分别是285.62，293.53 ，434.17 ，668.82，856.21 μg/ml。结论蛇足石杉内生真菌xg，g8，g5发酵醇提物能够较为显著地抑制乙酰胆碱酯酶，为寻找具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的药用资源开辟了一条新的途径。
       【关键词】  乙酰胆碱酯酶 蛇足石杉 内生真菌
       老年痴呆症（Alzheimer disease,AD）是一种严重危害人类健康的疾病。它的发病机理之一是在神经冲动传导过程中缺乏乙酰胆碱。乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）能分解乙酰胆碱，因此治疗AD的一个策略就是用AChE抑制剂来减少乙酰胆碱的消耗,从而提高胆碱能神经元的兴奋性,达到缓解症状的效果［1］。
        我国药学工作者从药用植物蛇足石杉Huperzia serrata(Thunb.trev)中提取得到高效、可逆的AChE抑制剂——石杉碱甲（HupA）［2］。由于蛇足石杉天然资源日渐枯竭，限制了石杉碱甲的开发利用。目前国内外学者主要是通过化学合成、植物组织培养来解决天然资源匮乏问题［3］。本文尝试从蛇足石杉内生真菌中寻找具有AChE抑制活性的菌株，为改善蛇足石杉资源寻找一条可能的出路。
       1  器材与方法
        1.1  供试内生真菌供试用29株内生真菌由本实验室李娜博士从安徽宣城地区野生蛇足石杉植株内分离得到（根，13株；茎，8株；叶,8株），经纯化后现保存于江苏大学生药学实验室，待分类鉴定。
        1.2  试剂及仪器碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide，ATCh）（Sigma D-8130）、5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸（DTNB）（Sigma A-5751）、石杉碱甲（HupA）纯品，中国科学院上海药物所朱大元教授惠赠；高氯酸，国药集团化学试剂有限公司AR级；医用95％乙醇，山东广源医药酒精有限公司。
        XD711酶标分析仪，上海迅达医疗仪器有限公司；spectra MAX190多功能酶标仪，美国MolecuLar Devices；R200/V旋转蒸发仪，德国BǔCHI公司；台式高速冷冻离心机，德国Beckman公司；SPX-250B生化培养箱，上海跃进集团；QYC-211摇床，上海福玛试验设备有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏净集团；U-410超低温冰箱，英国NEW BRUNSWICK SCIENTIFE公司。
        AChE粗提物的制备：取小鼠大脑组织制成 1％组织匀浆，即为AChE粗提物［4］。
        发酵液制备：采用马铃薯葡萄糖液体培养基培养蛇足石杉内生真菌， 28 ℃，120 r/min，发酵7 d，做为供试发酵液。
        蛇足石杉内生真菌发酵产物的粗制：供试发酵液反复冻融破碎菌丝体细胞，再经95％乙醇醇沉除杂蛋白、多糖，浓缩成醇浸膏。用5 ml热水温浸，充分混匀制成醇提物样品。取10 μl稀释100倍用于对AChE抑制活性的筛选。
        1.3   AChE活性检测方法以ATCh为底物、DTNB为显色剂 ,通过 ATCh被AChE水解产生胆碱与DTNB反应，释放出黄色产物5-巯基-2-硝基本甲酸(5"-mercapto-2"-nitrobenzoic acid)来检测酶活性［5］。
        AChE活性检测的基本操作过程［4］：在Eppendorf管中加入供试AChE粗提物、10 mmol/L ATCh，再加入0.05 mol/L PBS补平反应体系至390 μl,混匀，恒温37℃孵育30 min,加6％高氯酸10 μl，振荡混匀，室温下终止反应20 min，9 184×g离心1 min，取上清液，移入96孔板，每孔100 μl，共计3孔，再加0.05 mmol/L DTNB 100 μl反应显色(整个反应体系为200 μl)，酶标仪410 nm［6］处检测OD值。
        1.4   AChE体外酶促反应条件的优化［7］
        1.4.1  磷酸缓冲溶液pH的确定配制0.05 mol/L PBS（pH值分别为：6.0，6.4，6.8，7.2，7.6和8.0）3次重复，其它条件同“1.3”项所述，进行检测。
        1.4.2  反应温度的确定将酶标仪检测温度分别设定为27，32，37，42，47℃，3次重复，其它条件同“1.3”项所述，进行检测。
        1.4.3   底物ATCh浓度的确定改变底物浓度，观察不同浓度时AChE的活性，选择最合适的底物浓度。
        1.4.4   AChE粗提物用量的确定改变AChE粗提物的不同用量，确定酶促一级反应所用的粗提酶量范围。
        1.5  蛇足石杉内生真菌发酵产物对AChE抑制活性的筛选
        1.5.1  内生真菌发酵液醇提物样品的活性初筛发酵液醇提物样品稀释100倍后，取150 μl加入反应体系中进行检测，设为OD样品。每个醇提物样品都设一对应样品本底色，即不加底物，其他反应条件与供试样品一致，同上检测，设为OD本底。阴性对照用PBS代替醇提物样品，使酶促过程在没有抑制剂的作用下彻底进行，同上检测，设为OD阴性。阳性对照不加底物，其他反应条件同阴性对照，用以模拟AChE失活或完全被抑制，其他同上检测，设为OD阳性。3次重复，取平均值。设AChE抑制率为I（％），按（1）式［8］。
        I/％＝［(OD阴性-OD阳性)-( OD样品-OD本底)］
        /(OD阴性-OD阳性)×100%                  （1）
        1.5.2  内生真菌发酵液醇提物样品AChE抑制活性的IC50计算对抑制率达50％以上的发酵液醇提物样品计算IC50。
        1.6   统计方法采用SPSS13.0统计软件对所得结果进行一元方差分析（One-way ANOVA）。
       2   结果
        2.1   AChE活性检测条件优化结果
        2.1.1  磷酸缓冲溶液pH的确定如图1所示，AChE在缓冲液pH为7.2左右时酶活力最高，偏酸偏碱都会降低酶活力。
        2.1.2  反应温度的确定在缓冲液pH为7.2时，反应温度对AChE活性影响较大， 37℃时酶活性最高，然后随温度升高缓慢下降，见图2。
        2.1.3  底物ATCh浓度的确定如图3所示，当底物浓度在1～5 mmol/L之间时，酶反应速度与底物浓度呈依赖关系，随着底物浓度的增加，酶促反应加快。但当底物浓度大于5 mmol/L后，酶反应就不与底物浓度呈相关性，且呈现过量抑制作用。因此选择最适底物浓度为5 mmol/L。
        2.1.4   AChE粗提物用量的确定如图4所示，当酶用量在130 μl以内，酶用量与OD值呈线形相关，表明底物量足够大，使得酶促反应与底物浓度无关，只与酶量成正比，因此体系中酶促反应处于一级动力学状态，符合检测要求。但考虑到酶标仪OD值检测的准确度范围，本试验最适酶用量为50 μl。
        经优化得到的筛选抑制剂的酶促反应条件为：采用0.05 mol/L，pH=7.2的磷酸缓冲液，酶反应温度37℃；ATCh浓度5 mmol/L，AChE粗提物用量50 μl。在此条件下，反应较稳定也较灵敏，底物用量也最为节省。
        2.2  蛇足石杉内生真菌发酵液醇提物的AChE抑制活性筛选结果
        2.2.1  醇提物样品的活性初筛对蛇足石杉中分离出的29株内生真菌，在同一平行培养条件下进行发酵。根据优化的试验结果，对其发酵液醇提物进行了体外AChE抑制试验。见表1，菌株之间抑制活性的差异比较大，其中有4株内生真菌具有显著的抑制活性，占总筛选菌株数的13.8％，其抑制率分别达到81.19％，82.52％，83.12％和71.52％。且主要是从蛇足石杉根部分离得到的内生真菌（3株）。推测蛇足石杉叶与茎中的内生真菌可能与宿主抗外界的生物与非生物胁迫作用有关；而根部内生真菌可能协助宿主合成一些宿主代谢所必须的类似物或前体化合物［9］。因此根部内生真菌可能更易获得与蛇足石杉活性成分HupA类似活性的次生代谢产物。表1  不同菌株发酵液醇提物对AChE抑制效果NA,表示抑制率≤25％，认为无活性； *表示与其他各组比较，具有显著性差异，P< 0.05; n=3
        2.2.2  对有较显著抑制效果的发酵醇提样品作IC50由表2看出xg，g8，g5，xgc2，xy7对乙酰胆碱酯酶具有较高的抑制作用，其IC50分别是285.62 ，293.53，434.17，668.82，856.21 μg/ml。与阳性药物HupA比抑制效果低，推测是由于醇提物中有效成分含量较少的缘故。据报道，从宿主植物红豆杉中分离得到的内生真菌，其发酵物每升含有抗癌物质紫杉醇量仅为50 ng［10］，因此提示：提高内生真菌发酵物中有效成分的含量将是今后研究工作的重点。 表2  不同菌株抑制AChE活性的IC50 *表示与其他各组（除HupA阳性药物）比较，具有显著性差异，P< 0.05；**表示与其他各组（除HupA阳性药物）比较，具有极显著性差异，P< 0.01;n=3
       3  讨论
        按照内共生观点与协同进化观点［10］，宿主植物与内生真菌常具有相同或相似的次生代谢产物合成途径。植物内生真菌次生代谢产物丰富，是巨大的获取新天然化合物结构的宝库，几乎存在于所有已研究过的植物中。通过发酵大量生产或通过改进发酵工艺及菌种选育，可以提高所需化合物的含量。此次对安徽地区野生蛇足石杉的根、茎、叶中29株内生真菌进行筛选，得到5株具有显著抑制AChE活性的菌株：xy7，xg，g8，g5，xgc2，提示蛇足石杉内生真菌可能作为筛选具有抑制AChE抑制活性的新型候选药物资源。但其起效的物质基础并不清楚，还需进一步深入研究。
       【参考文献】
         ［1］ 韩大雄,杨 频.老年痴呆症的分子病理机制［J］.化学通报,2003,2:100.
       
       ［2］ Jian Pan,Risheng Jin,Xueqiao Hu.application of L-Amino acid in determination of Huperzine A by high performance liquid chromatography［J］.Journal Chromatography B.2006，836:108.
       
       ［3］ 张 磊,万谦宏,高文远.石杉碱甲的研究进展［J］.中草药,2005,36(9):1422.
       
       ［4］ 杜晓华.观赏植物马尾杉内生菌及其次生代谢产物对AChE的抑制活性［D］.西北农林科技大学,2003:21.
       
       ［5］ Naoki Nagatani,Akihiro Takeuchi. Rapid and sensitive visual detection of residual pesticides in food using acetylcholinesterase-based disposable menbrancs chips［J］.Food control, 2007，18: 914.
       
       ［6］ B.Vinutha.D.Prashanth,K.Salma,et al.Screening of selected Indian medicinal plants for acetylcholinesterase inhibitory axtivity［J］.Journal of ethnopharmacology,2007，109:359.
       
       ［7］ 杨宏云,徐国兵,夏铁安.人血清假性胆碱酯酶连续监测法测定方法学的建立及其在肝功能评价中的应用［J］.中国实验诊断学，2003，7（2）：83.
       
       ［8］ 董 杰.乙酰胆碱酯酶抑制法快速检测蔬菜农药残留技术的研究［D］.山东农业大学，2003:18.
       
       ［9］ 孙剑秋,郭良栋,臧 威,等.药用植物内生真菌及活性物质多样性研究进展［J］.西北植物学报,2006,26(7):1505.
       
       ［10］ Strobel G A. Harnessing endophytes for industrial microbiology［J］. Curr Opin Microbiol, 2006, 9(3): 240.