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       【摘要】 
       目的建立了一种无损的、可在线快速测定斯普林注射液中核糖和多肽含量的新方法。方法采用光谱仪扫描不同批次的斯普林注射液样品的紫外光谱，然后采用经典的分析方法测定对应样品中核糖和多肽的含量，应用径向基神经网络（RBFNN）建立了斯普林注射液样品的紫外光谱与其中核糖和多肽含量间的定量关系模型。通过选择最有效的光谱预处理方法、网络的最优拓扑结构参数和最佳扩展常数对模型进行最优化。结果应用最优模型对斯普林注射液预测集样品中核糖和多肽含量，预测均方根误差（RMSEP）分别为0.013 2和0.013 8。结论 紫外光谱方法测定斯普林注射液中核糖和多肽含量，预测精度高，方法简便可行，且多组分可同时测定，为测定中药组分含量提供了一条新途径。
       【关键词】  紫外光谱 径向基神经网络 斯普林注射液
       斯普林注射液（小牛脾提取物注射液）是用于提高机体免疫力的药物。从健康小牛健康脾脏中提取的高活性的分子多肽物能刺激骨髓肝细胞增殖，升高外周血白细胞，促进造血功能的恢复，有效地缓解化疗药物所导致的血细胞减少、出血等副作用，而且能激活机体免疫系统，明显地减轻患者疼痛，有效缓解化疗所导致的恶心、呕吐，恢复患者体力，改善睡眠，稳定情绪，增加食欲，提高患者生活质量［1］。李霞等［2］对贵州少数民族地区的住院治疗的88例晚期肿瘤病人进行了斯普林与参麦注射液对照治疗观察，结果显示斯普林对晚期癌症病人全身状况改善方面有较好的辅助治疗。斯普林注射液主要有效成分为核糖和多肽，而这些主成分常规分析方法主要为Folin酚法、高效液相色谱法［3］、凯氏定氮法［4］，分光光度法［5］等，这些方法均需要对样品进行预处理，需要很多有机试剂，操作繁琐，本文采用紫外光谱结合径向基神经网络［6］（RBFNN）建立快速无损定量分析斯普林注射液中核糖和多肽含量的新方法。
       1  器材
        1.1  仪器  紫外可见近红外分光光度计（UV-3150，日本岛津公司）。
        1.2  试剂与材料  斯普林注射液（吉林马应龙制药有限公司，中国）；D-核糖；三氯醋酸；牛血清白蛋白。
       2  方法与结果
        2.1  紫外光谱的采集  采用紫外可见近红外分光光度计对不同批次的斯普林注射液40个样品进行紫外光谱扫描，光谱波长范围设为200～400 nm，光谱通带宽度设置为2 nm，每个样品扫描3次，取平均光谱作为该样品的光谱。斯普林注射液紫外光谱如图 1，本文采用RBFNN建立斯普林注射液样品紫外光谱与其中的核糖和多肽含量间的定量分析模型，应用所建立的模型可同时测定斯普林注射液样品中核糖和多肽的含量，该方法具有简单、快捷、无污染和无预处理等优点。
        图1  斯普林注射液样品紫外光谱
        2.2  核糖含量的测定  精密称取D-核糖适量，用5%三氯醋酸溶液溶解制成20 μg/ml的标准溶液。分别精密移取0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 ml的标准溶液于具塞试管中，用5%三氯醋酸溶液定容至2 ml各加入3，5-二羟基甲苯溶液2.0 ml，摇匀，水浴中准确加热30 min，迅速冷却，于650 nm波长处测定吸光度，标准曲线回归方程为Y=22.080X-0.008，R2＝0.997。精密移取2 ml供试品液，按照标准曲线制备的方法测定不同批次斯普林注射液样品中核糖含量。表1  各样品集中核糖和多肽含量的统计
        2.3  多肽含量的测定  采用Folin酚法测定斯普林注射液中多肽含量，以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线，曲线回归方程为Y=1.369 9X-0.013 3，R2＝0.996，线性范围为0.025～0.250 mg/ml。
        斯普林注射液样品中核糖和多肽含量统计见表1。
        2.4  径向基神经网络定量分析模型的建立采用卷积平滑、一阶导数、二阶导数和标准正态变量转换（SNV）分别对所有斯普林注射液样品的紫外光谱进行预处理，然后采用主成分析方法对原始光谱和预处理后光谱矩阵进行主成分分析（PCA），根据第一主成分与第二主成分得分作图，将样品分为校正集、预测集和验证集样品，以主成分得分作为RBFNN网络的输入节点，以“2.2”项和“2.3”项所测得的核糖和多肽含量为输出节点，建立测定斯普林注射液中核糖和多肽含量的定量分析模型，为了避免模型出现过拟和，本实验引进逼近度（Da）为模型优化参数，对模型输入节点数、隐含节点数和扩展常数进行优化，逼近度（Da）的计算方法如式（1）和（2）：
        ea=［ncn］ec+［nvn］ev+│ec-ev│ （1）
        Da=cea（2）
        式中ea,ec,ev分别是逼近误差、校正集均方根误差（RMSEC）和验证均方根误差（RMSEV），n, nc, nv,分别为样品总数、校正集样品数和验证集样品数。C是常数(本文中C取0.000 1)，主要以调整Da大小方便于作图，模型的预测能力以预测均方根误差（RMSEP）来评价，RMSEC，RMSEV和RMSEP的算法可参考文献［7］。
        2.5  径向基神经网络模型的优化
        2.5.1  光谱预处理方法的选择  分别采用一阶导数、二阶导数、卷积平滑光谱和SNV光谱预处理方法对斯普林注射液样品的原光谱进行预处理，然后应用PCA的方法对原始光谱和各预处理后的光谱进行主成分提取，以主成分得分作为输入节点建立测定斯普林注射液样品中核糖和多肽含量的定量分析模型，各光谱所建立的最优模型的性能参数列于（表2），由表 2而可以看出，在测定核糖含量时，采用一阶导数光谱所建立的模型的RMSEC，RMSEP和RMSEV最小，同时它具有最大的Da值，而在测定多肽含量时，采用SNV光谱所建立的模型的RMSEC，RMSEP和RMSEV最小，Da值也为最大值，因此确定测定核糖和多肽含量时，最有效的光谱预处理方法分别为一阶导数光谱法和SNV方法。表2  原始光谱及不同预处理后光谱所建立的测定核糖和多肽含量最优模型的性能参数
        2.5.2  光谱输入节点数的选择  采用PCA方法对光谱进行分析，提取光谱前20主成分，分别以前3～20主成分的得分作为RBFNN的输入节点，为了避免模型出现过拟合的现象，以逼近度（Da）为评价标准，考察输入节点数对模型性能的影响见图2，由图 2可以看出，在测定核糖合多肽含量时候，最佳的输入节点数分别为10和13。
        图2  输入节点数对测定斯普林注射液中核糖与多肽
        含量的定量分析模型的RMSEC，RMSEV和Da的影响
        2.5.3  隐含节点数的选择  RBFNN是从0个神经元开始训练，通过检查输出误差使网络自动增加神经元，直到误差达到要求或是最大隐含层神经元数为止。隐含节点太少，拟合不充分；隐含节点增加得过多会过拟合。所以本文以Da为模型优化的标准，选出最合适的隐含层节点数。图 3是在最不同隐含节点数对Da的影响，由图 3可以看出测定核糖和多肽模型的最佳隐含节点数均为19。
        图3  隐含节点数对测定斯普林注射液中核糖
        与多肽含量的定量分析模型的RMSEC，RMSEV和Da的影响
        2.5.4  扩展常数的选择  扩展常数的大小关系到拟合函数变化的快慢，从而影响模型的拟合程度，以Da为标准，考察扩展常数在0.3～9范围内对模型的影响，以选择合适的扩展常数，结果如图 4所示，由图 4可以看出，在测定斯普林注射液样品中的核糖和多肽含量时模型最适的扩展常数分别为0.6和1.2。
        2.6  最优模型的建立  采用RBFNN结合紫外光谱建立测定斯普林注射液样品中核糖和多肽含量的定量分析模型，模型经过选择最有效的光谱预处理方法、最适的输入节点数、隐含节点数和扩展常数，得到最优的模型，应用最优的模型预测各样品集的核糖和多肽含量，预测值与化学测量值间的相关性如图 5，由图 5可以看出预测值与化学测量值吻合的很好，说明该方法可行。
        2.7  最优模型对预测集样品的预测  采用“2.6”项中所建立的最优模型对预测集样品中的核糖和多肽含量进行预测，预测均方根误差（RMSEP）分别为0.013 2和0.013 8，预测值和真实值列于表 3，计算预测值与真实值间的绝对误差和样品回收率，由表 3可以看出，核糖含量的预测值与真实值间绝对误差不大于0.023，平均回收率为101.224%，而多肽预测值间的绝对误差不大于0.033，平均回收率为101.651%，说明预测值与真实值吻合的比较好，模型预测能满足要求。表3  最优模型对预测集样品中核糖和多肽含量预测值与真实值统计结果
       3  讨论
        本实验应用径向基神经网络结合紫外光谱建立了测定斯普林注射液中核糖和多肽含量的定量分析模型，文中引进逼近度作为模型优化的参数，可有效地避免模型发生过拟合现象。模型经过优化后，对预测集样品中的多肽和核糖含量进行预测，预测均方根误差（RMSEP）达到0.0132和0.0138，说明模型具有很高的预测精度，可应用于斯普林注射液质量监测。
        本实验方便快捷，不需有机试剂，无污染，操作简单，并可两组分同时检测，质量准确，可应用于斯普林注射液生产的质量检测和在线监控。
       【参考文献】
         ［1］ 张吉凤, 赵 雷, 夏大文. 斯普林对小鼠免疫功能影响的研究［J］.中华肿瘤防治杂志, 2005, 12(7)：519.
       
       ［2］ 李 霞, 张 萍, 杜迎春, 等. 斯普林改善晚期恶性肿瘤全身状况的疗效观察［J］.肿瘤, 2005, 25(6)：633.
       
       ［3］ 张津枫, 王健刚, 邓国才, 等. 葡萄糖发酵液D-核糖含量的高效液相色谱分析［J］.高等学校化学学报, 2001, 22(1)：43.
       
       ［4］ 吕伟仙, 葛 滢, 吴健之, 等. 植物中硝态氮、氨态氮、总氮测定方法的比较研究［J］.光谱学与光谱分析, 2004, 24(2)：204.
       
       ［5］ 陈莲惠, 刘绍璞, 刘忠芳, 等. 碱性二苯基萘基甲烷染料褪色光度法测定透明质酸钠［J］.分析化学, 2004, 32(5)：698.
       
       ［6］ 毛利锋, 沈 明, 程翼宇. 毛细管电泳径向基神经网络校正法定量分析核苷［J］.化学学报, 2004, 62(19)：1917.
       
       ［7］ Guo W L, Meng Q F, Lu J H, et al. Rapid Determination of compound rifampicin tablets using near infrared spectroscopy with artificial neural network［J］.2006, ICCSA 2006, LNCS 3980：938.