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       【摘要】 
       目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）对乙醇损伤大鼠原代培养肝细胞保护的作用和机制。方法采用胰蛋白酶消化、分离大鼠肝细胞进行原代培养，乙醇体外诱导肝细胞损伤，以不同浓度的SS-d对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和肝细胞内丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法检测肝细胞存活率。结果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明显改善肝细胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，对肝细胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明显的抑制作用。结论SS-d对乙醇损伤大鼠肝细胞有保护作用，其机制可能与SS-d清除自由基、抑制质脂过氧化作用有关。
       【关键词】  乙醇 肝细胞 原代培养 柴胡皂苷-d 保护作用 机制
       随着人们生活水平的提高和饮酒量的增加，酒精对肝脏的损害日渐突出。了解酒精对肝损伤的机制，筛选有效预防和治疗酒精性肝损伤的药物应用于临床，是亟待解决的重要课题。目前，中药复方对酒精性肝损伤的实验研究和报道比较多，单味制剂报道较少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中药柴胡的有效成分，根据其化学结构不同可分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)药理活性作用最强。整体水平研究表明柴胡皂苷对酒精性肝损伤有预防作用［1］。本文建立体外乙醇损伤肝细胞模型，在细胞水平上进一步研究柴胡有效成分SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用机制。
       1   器材与方法
        1.1  药品与试剂  SS-d（纯度98%），昆明长春花科技有限公司提供，临用前以蒸馏水配制；Hanks液高压灭菌,4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装，-30℃保存；基础培养液，RPMI1640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml，过滤除菌，临用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，链霉素100 μg·ml－1，胰岛素5  μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。
        1.2  动物 SD大鼠，2～4 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。
        1.3  仪器 CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。
        1.4  肝细胞分离培养［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后断头放血，无菌分离肝脏，去除肝脏外膜及其周围结缔组织，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml,37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1 000 r离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>85%，按1 ×109个·L-1接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养24 h后更换培养液去除血细胞，继续培养72 h后进行分组实验。
        1.5   乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板，设正常对照组及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14个剂量组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，MTT法测定肝细胞存活率。
        1．6   MTT法选择SS-d的实验浓度 SS-d初浓度为5 mg/L，采用细胞培养液进行稀释，依次为5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。将肝细胞接种于96孔板培养72 h更换培养液，换用SS-d稀释液培养，另设空白对照组，12 h后吸出培养液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亚砜200 μl，混匀以溶解被还原的MTT结晶，检测波长为492   nm的光密度值，计算药物不同稀释浓度下细胞的存活率。
        1.7   SS-d对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用取培养72 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SS-d组加入乙醇100 mmol·L－1，同时SS-d组加入不同浓度的SS-d，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞检测MDA含量和GSH-px的活性，MTT法测定肝细胞的存活率。
        1.8  统计学处理  数据以 表示，用SPSS计算机软件进行统计学分析, 组间比较采用t检验，P<0.05有统计学意义。
       2   结果
        2.1   乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞，对细胞有剂量依赖性的损伤作用，25 mmol·L－1作用不明显，光镜下细胞形态基本正常，随着浓度的增大，肝细胞存活率呈进行性降低，反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高；镜下观察肝细胞损伤明显，细胞结构不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明显，我们选择乙醇浓度为100 mmol ·L－1制备肝细胞损伤模型。见表1。表1  不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响 与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
        2.2   SS-d 实验浓度的选择SS-d不同浓度时细胞存活率见表2，为避免药物浓度过大所致的细胞毒性作用，应选择对细胞生长无明显影响即肝细胞存活率在90%以上的浓度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作为实验所用药物浓度。见表2。表2  不同浓度SS-d对肝细胞存活率的影响与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6
        2.3   SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝细胞后，肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，细胞内ALT释放量明显升高，细胞内MDA含量明显增高,GSH-px活性明显下降；而给予SS-d保护后， 培养液中ALT水平明显降低；肝细胞MDA含量明显降低，GSH-px活性明显升高；并且肝细胞存活率明显升高。具有明显的剂量依赖性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构，其保护作用可能与抗脂质过氧化作用有关。见表3。表3  SS-d对乙醇损伤肝细胞ALT，MDA，GSH-px水平与对照组比较，*P＜0.01,与模型组比较#P＜0.05,##P＜0.01；n=6
       3  讨论
        大量研究表明，乙醇对肝细胞损伤是通过自由基介导脂质过氧化作用进行的［3～5］。乙醇在肝脏代谢时产生大量自由基，自由基除直接损伤肝细胞外，可引起肝细胞膜发生脂质过氧化反应，使细胞膜和细胞器结构破坏，膜流动性失常，大量肝内酶（ALT，AST）释放入血，并可抑制抗氧化剂谷胱甘肽的合成，减弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝细胞代谢紊乱，肝功能异常，肝细胞广泛脂肪样和空泡样变性，最终导致细胞肿胀死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂质过氧化反应，才能保护肝细胞，恢复肝细胞结构和功能的完整性。
        SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS对实验性肝损伤具有明显的保护作用［7，8］。但对单体SS－d保肝作用研究报道较少。因此，我们利用乙醇制备体外肝细胞损伤模型，在细胞水平上对SS-d保肝作用机制进行探讨。本研究显示，模型组肝细胞培养液中ALT活性明显升高，肝细胞脂质过氧化反应产物MDA含量增加，GSH-px活性降低，细胞存活率明显下降，表明乙醇可引起肝细胞氧化损伤；给予SS－d保护后，和模型组比较，肝细胞培养液中ALT活性明显较低，MDA含量明显降低，GSH-px活性明显升高，肝细胞存活率亦有明显升高。提示，SS-d对乙醇损伤肝细胞有明显保护作用，其机制可能是：①SS-d能增强机体内抗氧化防御能力，抑制自由基的产生；②稳定肝细胞膜系统，提高膜结构的稳定性，促进肝细胞增殖，防止肝细胞损伤和坏死。
       【参考文献】
         ［1］ 李素婷，齐洁敏，杨鹤梅，等. 柴胡总提物对大鼠酒精性肝损伤的保护作用［J］.承德医学院学报，2007，24（1）：9.
       
       ［2］ 谢华福，甘 淋，李 娟，等. 一种简单的肝细胞分离、培养和鉴定方法［J］.泸州医学院学报，2003，26（4）：306.
       
       ［3］ Sergent O,Pereira M,Belhomme C,et al.Role for membrane fluidity in ethanol-induced oxidative stress of primary rat hepatocytes［J］. J Pharmacol Exp Ther,2005,1:5.
       
       ［4］ Stewart SF,Vidali M,Day CP,et al.Oxidative stress as a trigger for cellular responses in patients with alcoholic liver disease［J］. Hepatology,2004,39:197.
       
       ［5］ 邓 源，班春林，武晓琼. 乙醇诱导肝损伤作用机制的研究进展［J］. 华北国际医药，2005，17（4）:242.
       
       ［6］ Hock J B,Pastorino J G.Ethanol,oxidative stress,and cytokine-induced liver cell injury［J］.Alcohol,2002,27(1):63.
       
       ［7］ 杨 错，邢立国，刘玉兰. 柴胡对大鼠实验性肝纤维化的预防作用［J］. 实用药物与临床，2005，8（5）：12.
       
       ［8］ 刘仁慧，王宪龄，刘方洲，等. 柴胡黄芩配伍抗大鼠急性酒精性肝损伤作用的实验研究［J］. 时珍国医国药，2006，17（2）：163.