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       【摘要】 
       目的以山楂对照药材和熊果酸作为对照品，分别建立薄层色谱（TLC）鉴别和高效液相色谱（HPLC）法控制山楂精降脂胶囊的质量。方法TLC鉴别用甲苯-醋酸乙酯-甲酸（20:4:0.5）为展开剂；HPLC法采用Alltima C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mn），用乙腈-甲醇-水-乙酸铵(70:16:14 :0.5)为流动相，检测波长220 nm；柱温25℃；流速1.0 ml/min。结果TLC鉴别图谱斑点清晰，阴性无干扰；熊果酸含量1.796 8～17.968 0 μg范围内呈良好线性关系，得回归方程Y＝44 820X+5 725.5，r=0.999 9，平均加样回收率及RSD分别为101.17%和1.02%。结论以熊果酸为对照品，采用TLC法和HPLC法控制山楂精降脂胶囊质量的方法简便快速、准确可靠、重复性好，专属性强。
       【关键词】  山楂精降脂胶囊 薄层鉴别 高效液相色谱 熊果酸
       山楂精降脂胶囊是由山楂提取物制成的中药单方制剂，是由山楂精降脂片经剂型改变而来，功能与主治为降血脂，可用于治疗高血脂症，亦可作为冠心病和高血压病的辅助治疗［1］。文献报道山楂主要含黄酮类有机酸和三萜类等有效成分，其中金丝桃苷、熊果酸是山楂中黄酮和三萜类物质的主要成分［2，3］。研究表明黄酮类成分具有降压、增加冠脉血流量、降血脂、强心和抗心律失常的药理作用，而三萜类成分有降低高脂模型小鼠血脂的作用［4～7］。原标准只有理化鉴别和UV法测定总黄酮的含量，专属性不强。为了提高产品的质量可控性，以山楂对照药材及熊果酸对照品为对照，探讨TLC鉴别和HPLC法测定熊果酸含量的质量控制法。
       1   器材
        1.1   仪器  高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)：P200 II型高压恒流泵，UV200 II 紫外可变波长检测仪，Rheodyne 7725i 高压六通进样阀，20 μl定量环；HW色谱工作站（南京千谱软件有限公司）；百万分之一电子天平（瑞士Mettler公司M3型）。
        1.2   试药 山楂精降脂胶囊（由本实验室自制）；山楂对照药材(中国药品生物制品检定所，批号：121138-200403)；熊果酸对照品（供含量测定用，中国药品生物制品检定所，批号:110742-200415）；乙腈、甲醇为色谱纯（中国医药集体上海化学试剂公司）；水为自制的重蒸水，其余试剂均为分析纯。
       2   方法与结果
        2.1  山楂的薄层鉴别取山楂精降脂胶囊4粒，倾出内容物，加甲醇25 ml，超声30min，滤过，滤液浓缩至2 ml，作为供试品溶液；另取山楂对照药材1 g，加70％乙醇25 ml，回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水5 ml溶解并加盐酸5 ml（6 mol/L），水浴水解30   min，抽滤，滤液弃去，滤渣加水洗至洗涤液呈中性,滤渣连同滤纸80℃干燥后，加甲醇25 ml，超声提取30 min，滤过，滤液浓缩至1 ml，作为对照药材溶液。取熊果酸对照品，加甲醇制成每1毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［8］试验，吸取供试品溶液5 μl、对照药材溶液5～10 μl、对照品溶液4 μl，分别点于同一含0.2%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-醋酸乙酯-甲酸（20∶4∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，105℃加热数分钟。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图1。
        1,2,3.供试品  4.山楂对照药材  5.熊果酸对照品  6.阴性对照
        图1  山楂精降脂胶囊薄层鉴别
        2.2   熊果酸的含量测定
        2.2.1   色谱条件 色谱柱为Alltima 5U C18（5 μm，4.6 mm×250 mn）；流动相为乙腈-甲醇-水-乙酸铵(70:16:14 :0.5)；使用前用孔径为0.45 μm的有机滤膜减压过滤，超声20 min；检测波长220 nm，柱温25 ℃，流速1 ml/min；进样量20 μl。
        2.2.2   可行性试验  精密称取熊果酸对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每毫升含熊果酸约400 μg的溶液，即得，作为对照品溶液。取本品20粒，倾出内容物，混合均匀，精密称取适量（约0.5 g）置50 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理40 min，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得，作为供试品溶液。分别取熊果酸对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2～4，从图2～4中可知熊果酸保留时间为15.8 min左右，阴性对照在相应的位置处无干扰峰，说明本品在上述色谱条件下熊果酸与其它组分分离较好。理论板数以熊果酸计算不低于3 000。
        2.2.3   线性关系考察  精密称取熊果酸对照品22.460 mg，置25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得0.8984 mg/ml的对照品溶液。分别精密量取上述对照品溶液1，2，4，6，8 ml至10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得不同浓度的对照品溶液。分别吸取上述各对照品溶液及母液各20μl注入色谱仪，测定其峰面积，以熊果酸对照品进样量为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明在1.796 8～17.968 0 μg范围内进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系，回归方程为Y=44 820X+5 725.5，r=0.999 9（n=5）。
        2.2.4    样品超声时间考察  取装量差异下的内容物约0.5 g，精密称定，称取4份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，分别超声20，30，40，50 min［250W，（26.5±1）kHz］，放冷，再称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。依上方法测定，结果表明超声20，30，40，50 min的熊果酸含量分别为18.998 6，19.304 7，19.992 8，19.454 4 mg/g，可知样品超声提取40 min即可。
        2.2.5    精密度实验精密吸取对照品溶液20 μl，重复进样6次，求得熊果酸峰面积积分值的相对标准偏差RSD为1.0%。
        2.2.6    稳定性实验  精密吸取20 μl供试品溶液，以第1次进针为0 h，分别在0，1，2，4，8，12 h进针，测定其中熊果酸峰面积积分值，结果表明样品在12 h内稳定，RSD为1.8％。
        2.2.7    重复性实验  按样品测定项下方法，取同一批号山楂精降脂胶囊样品6份, 精密称定，按供试品制备方法制备供试品溶液，照上述测试方法实验，6个实验样本平均含量为16.797 5 mg/g，RSD为2.3％，结果表明本法的重复性很好。
        2.2.8    加样回收率实验取本品已知含量，同一批号（批号：20040701）样品共6份，每份约0.25 g，精密称定，精密加入一定量熊果酸溶液，照上述供试品制备方法制备供试品溶液，按含量测定方法测定熊果酸含量（见表1）。结果表明本法回收率较高，方法可行。表1  山楂精降脂胶囊的熊果酸含量测定加样回收实验结果  回收率（%）=实测量-样品中的量对照品加入量×100%
        2.2.9    样品测定  按上述方法制备供试品溶液和对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，依上述色谱条件测定，计算1粒（0.15 g/粒）毛冬青胶囊中原儿茶醛含量，先后测定了10批样品，每批测2次，结果见表2。依据测定的结果暂定本品每粒含山楂以熊果酸（C30H48O3）计不得少于2.3 mg。 表2  山楂精降脂胶囊样品的熊果酸含量测定结果
       3  讨论
        山楂精降脂胶囊是由山楂药材提取物组成的单方制剂。山楂中含有山楂酸、酒石酸、胡萝卜素、维生素B1、维生素B2、维生素C、黄酮类、内酯、糖类及苷类、有机酸、鞣质、蛋白质、脂肪、钙、磷、铁等。迄今为止，国内外学者从山楂中已分离得到槲皮素、金丝桃苷、芦丁等。原片剂标准中有两个理化鉴别和1个含量测定指标（以槲皮素为对照品，运用UV法进行总黄酮的含量测定），理化鉴别由于专属性不强而被删去，而总黄酮含量在山楂提取物原料中已控制，制剂中再控制同一指标意义不大，且供试品处理方法繁琐，故在新制剂中未采用该法。山楂中有机酸类含有熊果酸，它有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、保肝、降血脂等作用，选择其作为控制质量标准的指标之一，具有一定的实际意义。因此，本研究中选用熊果酸对照品和山楂对照药材为对照，新建立了制剂薄层鉴别，彩照斑点清晰，阴性无干扰，与理化鉴别相比，专属性大大增加，提高了制剂质量的可控性。结合本制剂的实际情况，通过对流动相不断摸索，采用高效液相色谱法测定制剂中熊果酸的含量，取得成功，方法简便可行，准确可靠，使制剂的质量更加可控。
       【参考文献】
         ［1］ 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂,第9册［S］.
       
       ［2］ 石岩鹏, 丁杏苞. 山楂化学成分的研究［J］. 中草药, 2000, 31 (3) :173.
       
       ［3］ 孙敬勇, 杨书斌, 谢鸿霞, 等.山楂化学成分研究［J］. 中草药, 2002, 33(6):483.
       
       ［4］ 罗玉梅, 王贺振. 山楂的化学成分及药理研究进展［J］. 时珍国医国药, 2004, 15(1):53.
       
       ［5］ 王月刚, 陈素云. 山楂对心血管系统的药理作用研究［J］. 中医药信息, 2000, 6:29.
       
       ［6］ 李贵海, 孙敬勇, 张希林,等.山楂降血脂有效成分的实验研究. 中草药, 2002, 33(1):50.
       
       ［7］ 薛庆玲, 牛绍忠, 田中云. 山楂及其叶对心血管系统的作用研究进展［J］. 山东医药工业, 2000，9(3):21.
       
       ［8］ 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:附录ⅥB.