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       【摘要】 
       目的通过采用高倍显微镜、免疫组化的方法，检测药物流产的绒毛、蜕膜组织坏死率以及增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白和细胞凋亡相关基因-2（Bcl2）的表达，探讨活血化淤，祛淤下胎的中药古方脱花煎协同米非司酮、米索前列醇终止早期妊娠的作用机理。方法对在70例临床疗效研究中收集到的完整的药物流产标本25例（其中观察组8例，对照组17例），采用前瞻性的对照研究方法，检测两组的绒毛、蜕膜组织结构坏死率以及PCNA蛋白和Bcl2的表达。结果两组的绒毛、蜕膜组织结构坏死率比较有显著差异（P<0.05）；两组的PCNA蛋白阳性表达率有显著性差异（P<0.05）；两组的Bcl-2阳性表达率无显著性差异（P>0.05）。结论脱花煎协同米非司酮、米索前列醇可增加早期妊娠的绒毛、蜕膜组织结构坏死率，提高流产效果；脱花煎协同米非司酮、米索前列醇可降低药物流产的绒毛、蜕膜组织的PCNA蛋白表达，促进妊娠组织细胞凋亡，提高流产效果；脱花煎协同米非司酮、米索前列醇对药物流产蜕膜组织的Bcl-2表达与米非司酮、米索前列醇组无明显差异。
       【关键词】  脱花煎 米非司酮 米索前列醇 增殖细胞核抗原 细胞凋亡相关基因2
       经过阅读复习文献发现，对中药药物流产的研究绝大多数集中在临床疗效、减少副作用等方面的探讨，且中药的使用时间大多数是在妊娠组织排出后，目的在于缩短阴道流血时间和减少流血量［1］，鲜见对其作用机制方面的深入探讨。本研究采用活血化淤、祛淤下胎的中药古方脱花煎协同米非司酮、米索前列醇终止早期妊娠，观察其对早期妊娠的绒毛、蜕膜组织结构坏死率以及对细胞滋养细胞胞浆增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白和细胞凋亡调控因子细胞凋亡相关基因-2（Bcl-2）表达等方面的影响，探讨其终止早期妊娠的作用机制。
       1  临床资料
        1.1  研究对象 研究对象均来源于200609～200702在广州中医药大学第一附属医院妇科就诊，要求药物终止妊娠者。所有研究对象严格按照下列的诊断标准、纳入标准和排除标准进行筛选，按SAS9.0系统设置的随机方法分组，对在70例临床疗效研究中（观察组34例，对照组36例）能完整收集到的流产标本25例按原分组方法分为观察组8例，对照组17例。
        1.2  诊断标准①停经日数≤49 d，HCG阳性；②确诊为宫内妊娠（B型超声见到宫腔内有妊娠囊）。
        1.3  纳入标准①符合上述诊断标准者；②年龄18～42岁之间；③血分析正常；④本人自愿使用药物终止早期妊娠，签署知情同意书者。
        1.4  排除标准①不符合诊断标准和纳入标准者；②对米非司酮或米索前列醇过敏者；③可疑异位妊娠，妊娠剧吐者；④有生殖器官肿瘤或畸形者；⑤合并有心血管、脑血管、糖尿病、甲状腺病、肝肾和造血系统等严重疾病及精神病患者；⑥有肝炎、结核等传染病者；⑦患者不合作，无法按方案进行者。
       2  研究方法
        2.1  服药方法
        2.1.1  观察组(脱花煎+米非司酮、米索前列醇组)  ①口服米非司酮150 mg，服药前后均空腹2 h。②口服米非司酮后2 h，开始服中药脱花煎，2剂/d，共3 d，水煎服［中药脱花煎组成：当归15 g，川芎10 g， 肉桂3 g（焗服），川牛膝15 g，红花3 g，车前子15 g］ 。③48 h后口服米索前列醇600 μg，服药前后均空腹2 h。
        2.1.2  对照组（米非司酮、米索前列醇组）服药方法同观察组①③。
        2.2  标本收集及处理  将药流排出的绒毛、蜕膜组织，马上用10%福尔马林固定后，将所得到的绒毛及蜕膜组织，制作芯片，常规包埋，切片，备用于检测。每张切片中均有观察组、对照组，以保证检测条件一致。
        2.3  检测方法 采用高倍显微镜检测绒毛、蜕膜组织结构坏死率；采用免疫组化的方法检测PCNA和Bcl-2的表达。免疫组织化学染色结果判断：(-)无染色信号。(+)染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以下。(++)染色信号呈细颗粒状，棕黄色，阳性细胞占总细胞数50%以上；或染色信号呈粗颗粒状、块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50%以下。(+++)染色信号呈粗颗粒状或块状，棕黑色，阳性细胞占总细胞数50%以上。
        2.4  统计方法采用SPSS11.0统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。
       3  结果
        3.1  一般资料两组孕者的年龄、孕周比较 见表1。表1  两组孕者的年龄、孕周比较两组的年龄分布差异无显著性(P>0.05)，具有可比性。其中观察组最大年龄为34岁，最小年龄为20岁；对照组最大年龄为41岁，最小年龄为20岁。两组的孕周分布差异无显著性(P>0.05)，具有可比性。
        3.2  两组的绒毛、蜕膜组织结构坏死率比较见表2。 表2  绒毛、蜕膜组织结构面积的坏死率比较 经独立样本t检验，观察组比对照组绒毛及蜕膜组织变性坏死面积更大，坏死程度更彻底，两组比较有显著性差异（P<0.05）。
        3.3  两组的蜕膜PCNA蛋白表达结果比较见表3。由表3可见，PCNA在观察组的蜕膜组织表达多为+-++，而对照组多为++-+++，有组间差异(P<0.05) 。表3  两组蜕膜PCNA蛋白表达结果比较
        3.4  两组的绒毛、蜕膜Bcl-2表达结果比较见表4。由表4可见，在绒毛合体细胞滋养层细胞浆和蜕膜中，两组Bcl-2均呈强阳性表达，无组间差异(P>0.05)。表4  两组的绒毛、蜕膜Bcl-2表达结果比较 例
       4  讨论
        脱花煎出自《景岳全书·妇人规》，由当归、川芎、肉桂、川牛膝、红花、车前子组成。功效为理气行血，祛淤下胎。方中当归、川芎活血，川芎又能行血中之气；肉桂温通血脉，红花祛淤，牛膝引血下行；车前子软坚滑利以下胎。合而用之，淤血去而死胎下。现代药理研究证实［2］：①当归含有兴奋子宫和抑制子宫两种不同成分，对多种动物已孕、未孕的离体子宫、在位子宫具有“双向性”调节作用。当归的兴奋成分为水溶性甚高、溶于醇而不溶于醚的非挥发性物质，能使子宫平滑收缩加强，大量或多次给药时，甚至可出现强直性收缩。醇溶性物质比水溶性物质作用强。当归的抑制成分为高沸点挥发油，1∶50浓度即对子宫产生迅速而持久的抑制作用，使子宫肌弛缓，节律性收缩减少，1∶25浓度即可使收缩完全停止、但洗去药液后子宫收缩可恢复，对子宫无明显损害。②川芎浸膏能使孕兔离体子宫收缩加强，甚至痉挛；大剂量则转为抑制，使子宫麻痹，收缩停止。川芎浸膏给妊娠兔或大鼠连续注射，可使胎仔坏死在子宫内，但不堕下，推测胎仔的坏死可能受川芎的作用引起痉挛而影响胎仔营养有关。③牛膝具有兴奋子宫和抗生育作用，牛膝流浸膏或煎剂对离体子宫家兔不论已孕、未孕均有兴奋作用，对收缩无力的小鼠离体子宫，则使收缩加强，对猫的未孕子宫成弛缓作用，而对已孕子宫则发生强有力的收缩，牛膝总皂苷在0.125～1.0 mg/ml的浓度内，对大鼠子宫平滑肌有明显兴奋作用，给药后子宫收缩幅度增高，频率加快，张力增加，子宫收缩面积较给药前显著增大。有报告指出，怀牛膝总皂苷给小鼠灌胃并有明显的抗着床作用。④红花煎剂对小鼠、家兔、猫、豚鼠、狗等动物在体或离体子宫均有不同程度的兴奋作用，小剂量可使子宫紧张性或节律性收缩，大剂量可使子宫紧张性与兴奋性升高，子宫收缩，甚至痉挛。此作用对已孕子宫较未孕子宫更为明显。
        根据表1：观察组和对照组年龄、孕周比较无显著性差异(P>0.05)，说明两组一般资料均衡，具有可比性。
        根据表2：观察组和对照组的绒毛、蜕膜组织结构面积坏死率分别为（43.75±34.62）%和（24.76±14.68）%，两组比较有显著性差异（P<0.05）。实验中，发现观察组绒毛、蜕膜组织细胞呈不同程度的退行性变、水肿，可见炎细胞浸润、，变性、坏死，少数细胞核固缩、破碎，细胞质不均匀及空泡变性，部分组织细胞界限不清，相互融合，正常组织细胞结构破坏，其坏死面积明显高于对照组，有组间差异（P<0.05）。本研究表明，同服中药脱花煎3 d可以增加绒毛、蜕膜组织结构的坏死面积，从而提高流产效果。根据现代药理研究结果，脱花煎中的当归、红花、牛膝等活血化淤中药可兴奋子宫，加强宫缩，加速松解蜕膜组织与子宫壁之间的联系，使其血液供应减少，局部营养缺乏，坏死面积增加，因此中药脱花煎协同米非司酮、米索前列醇可提高流产效果。
        根据表3：观察组的PCNA蛋白的阳性表达率明显低于对照组。PCNA是DNA聚合酶的一种辅酶，分子量为36 kda，直接参与核内DNA的合成，与细胞增殖活动有密切关系。PCNA是细胞的增殖指标，只要存在细胞增殖，就有PCNA表达［3］。PCNA是细胞周期特定时相内的表达蛋白，仅在增殖细胞中合成并表达，在S期合成达高峰［4］。因此，其含量多寡反映了细胞的增殖活性。本研究结果表明：观察组的细胞增殖活性明显低于对照组，说明配伍脱花煎可明显降低早期妊娠绒毛、蜕膜的细胞增殖活性，反证了其能增加胚胎细胞组织的凋亡指数，从而表明配伍脱花煎同服可提高流产效果。这可能是由于活血化瘀中药可有效地松解蜕膜组织与子宫壁之间的联系，减少其营养及血供，使细胞缺少营养，活性减低，有效地抑制了细胞增殖指数PCNA蛋白的表达。
        根据表4：两组在绒毛合体细胞滋养层细胞浆和蜕膜中的Bcl-2均呈强阳性表达，无组间差异(P>0.05)。Bcl-2家族是迄今研究的最深入和广泛的凋亡基因之一。细胞凋亡又称程序性细胞死亡,是由基因控制的细胞自我消亡过程，是细胞生命周期的重要环节。细胞凋亡是一种主动的、固有的现象，它发生在胚胎发育、生物变态、内分泌器官的萎缩及正常组织的修复更新过程中［5，6］。本研究中两组Bcl-2均呈强阳性表达，一方面可能是由于米非司酮的作用已使Bcl-2呈强阳性表达，无法体现出中药脱花煎对Bcl-2表达的影响。另一方面也可能是脱花煎对Bcl-2表达的影响很小或没有意义，仍需做进一步的研究。
        综上所述，脱花煎协同米非司酮、米索前列醇可增加早期妊娠的绒毛、蜕膜组织结构坏死率，从而提高流产效果；脱花煎协同米非司酮、米索前列醇可降低药物流产的绒毛蜕膜组织PCNA蛋白的表达，促进妊娠组织细胞凋亡，从而提高流产效果；脱花煎协同米非司酮、米索前列醇对Bcl-2的表达与米非司酮、米索前列醇组无明显差异。
       【参考文献】
         ［1］ 姜翠英，吴永庆.脱花煎辅助早期妊娠药物流产中100例临床观察［J］.甘肃科技，2004，20（10）：182.
       
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       ［3］ Hall PA ,Levison DA, Woods AL, et al. Proliferationing cell nuclear antigen (PCNA) immunolocation in paraffin section: An index of cell proliferation with evidence in some neoplasms［J］. J Pathol,1990,162:285.
       
       ［4］ Lipponen PK, Eskelinen MJ .Cell proliferation of transitioning cell bladder tumor determined by PCNA cyclin immunostaining and its prognostic valye［J］. Br J Cancer,1992, 66：171.
       
       ［5］ Dai D, Mouiton BC，Ogle TF，etal. Regression of the decidualized mesometrium and decidual cell apoptosis are associated with a shift in expression of Bc1-2 family members［J］.Biol Reprod, 2000, 63(1)：188.
       
       ［6］ 丁 峰，邢福祺，陈士岭，等.米非司酮对人早孕期蜕膜细胞凋亡及其调控基因bcl-2/bax的影响［J］.现代妇产科进展，2002，11（1）：36.