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       【摘要】 
       目的探讨低分子姬松茸多糖(a low molecular weight polysaccharide isolated from Agaricus blazei, LMPAB)对人肝癌细胞Bel-7402端粒酶-RNA mRNA表达的影响。方法5，10和20 μg·ml-1浓度的LMPAB处理体外培养的Bel-7402细胞48 h后，采用原位杂交法检测端粒酶-RNA mRNA表达。结果LMPAB下调体外培养Bel-7402 端粒酶-RNA mRNA的表达，呈剂量依赖性。与空白对照组比较，端粒酶-RNA mRNA的表达差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论LMPAB具有下调端粒酶-RNA mRNA表达的作用，进而降低端粒酶活性，抑制肿瘤细胞生长。
       【关键词】  低分子姬松茸多糖 抗肿瘤 端粒酶
       端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最为广谱的分子标记，在绝大多数恶性肿瘤中阳性表达，而在造血细胞和胚胎肝细胞以外的正常组织细胞内为阴性表达，端粒酶活性是恶性肿瘤发生重要标志之一［1］。肿瘤细胞经化疗杀伤或诱导分化后端粒酶活性显著降低，提示针对端粒酶活性的药物可能为治疗肿瘤提供新的途径［2］，端粒酶可作为抗肿瘤治疗的一个新靶点。多糖是由单糖连接而成的生物大分子物质，多糖的糖链能控制细胞的增殖和分化，调节细胞的生长与衰老，在抗肿瘤和促进免疫力方面疗效明确，毒副作用小［3］。近年来，多糖的抗肿瘤活性研究受到越来越广泛的关注。本研究采用原位杂交法，观察低分子姬松茸多糖（a low molecular weight polysaccharide isolated from Agaricus blazei, LMPAB）对Bel-7402细胞端粒酶-RNA mRNA表达的影响，探讨LMPAB抗肿瘤的机制。
       1  器材与方法
        1.1  材料
        1.1.1  药物  LMPAB由齐齐哈尔医学院医药科学研究所分离提取［4］；猪苓多糖注射液购自江苏省正大天晴药业股份有限公司；姬松茸粗多糖购自浙江庆元博瑞药业有限公司。
        1.1.2  细胞  Bel-7402 细胞株购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
        1.1.3  试剂与仪器 DAB kit/DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；RNase-free H2O（宝生物工程有限公司）；RPMI-1640 MEDIUM cell culture reagents（Hyclone）；Trypsin 0.25% Solution（Hyclone公司）。PM-20型全自动显微摄影仪（日本OLYMPUS）；COIC型倒置显微镜（重庆光学仪器厂）；Motic Med 6.0数码医学图像分析系统（北京麦克奥迪图像技术有限公司）。SuperFrostPlus原位杂交专用载玻片（美国Erie科技公司）；原位杂交专用盖玻片（武汉博士德生物工程有限公司）。
        1.1.4  杂交探针序列  端粒酶-RNA：①5"-TAGGC GCCGT GCTTT TGCTC CCCGC GCGCT-3"；② 5"-AAAAT GTCAG CTGCT GGCCC GTTCG CCCCT-3"；③5"-GATTC CCTGA GCTGT GGGAC GTGCA CCCAG-3"。
        1.2  方法
        1.2.1  细胞培养  从液氮罐中取出保存Bel-7402冻存管，迅速放置37℃温水中轻轻摇动，使其尽快融化。在超净工作台内用酒精消毒冻存管后，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管，并加10倍培养液，混合后低速离心，除去上清液，重复洗涤细胞1次。分别加入5 ml DMEM培养液，吹散细胞，将细胞悬液吸至培养瓶中，放入37℃、5% CO2浓度的培养箱中培养过夜。次日，观察细胞生长贴壁情况，更换新鲜培养液，继续培养。待细胞生长到覆盖80%瓶底壁时，准备传代。倒掉瓶内旧培养液，加适量0.25%胰酶，使消化液流遍所有细胞，37℃消化细胞约5 min，显微镜下观察细胞变形，加入含血清的培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打贴壁的细胞，使细胞完全脱落。将细胞悬液移入离心管，1 500 r/min离心5 min，弃上液，加入适量DMEM培养液吹散细胞。取适量细胞悬液在显微镜下用细胞计数板计数，然后按一定细胞数量分别接种于新的培养瓶中，放入37℃、5% CO2浓度的培养箱中培养。
        1.2.2  细胞爬片的制备  当Bel-7402细胞处于对数生长期，倒掉培养瓶内旧培养液，加适量0.25%胰酶，37℃消化约5 min。显微镜下观察，细胞脱落变形后，加含血清培养液终止消化，并用吸管轻轻反复吹打，使贴壁细胞完全脱落。将细胞悬液移入离心管，1 500 r/min 4℃离心5 min，弃上液，加入适量的DMEM培养液吹散细胞。取适量细胞悬液计数，用RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清）将细胞悬液浓度调整为1×105 cell·ml-1。预先在24孔培养板孔内滴几滴培养基，取约1/3大小的SuperFrostPlus原位杂交专用载玻片置于无菌24孔培养板中，取细胞悬液传代于培养孔内，每孔加细胞悬液500 μl（5×104cell）后，分别加入浓度为LMPAB 10 μg·ml-1、LMPAB 20 μg·ml-1、LMPAB 40 μg·ml-1、姬松茸粗多糖200 μg·ml-1、猪苓多糖2 000 μg·ml-1和不含药物的培养液各500 μl，每组6个平行孔，使总体积达1 000 μl。混匀后置37℃，5% CO2和95%湿度条件下培养48 h后，取出载玻片，将爬有细胞的玻片浸入4%多聚甲醛/0.1 M PBS（含有1/1 000 DEPC，pH 7.2）固定液室温固定30 min。标本取出，DEPC处理水洗涤3次，电风扇迅速吹干后，细胞爬片放入切片盒，-20℃冷冻备用。
        1.2.3  原位杂交法染色  细胞涂片在室温自然干燥2 h；涂片置于用30% H2O2 1份与纯甲醇50份混合液中，室温浸泡30 min以灭活内源性酶，DEPC处理的蒸馏水洗3次；切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶，室温消化1 min；用原位杂交用的PBS洗5 min×3次；DEPC处理的蒸馏水洗1次；用含有1/1 000 DEPC的1%多聚甲醛/0.1MPBS室温固定10 min，蒸馏水洗涤3次；在干的杂交盒底部加20%甘油20 ml以保持湿度，按每张切片20μl加预杂交液，恒温箱40℃预杂交4 h；吸取多余液体，不洗。每张切片加20 μl杂交液，揭开原位杂交专用盖玻片的保护膜后，盖在切片上，恒温箱40℃杂交过夜；揭掉盖玻片，37℃左右水温的2×SSC洗涤，5 min×2次；37℃ 0.5×SSC洗涤15 min×1次；37℃ 0.2×SSC洗涤15 min×1次；滴加封闭液，37℃ 30 min；甩去多余液体，滴加生物素化鼠抗地高辛，室温120 min，用原位杂交用PBS洗5 min×4次；滴加SABC，室温30 min，原位杂交用PBS洗5 min×3次；滴加生物素化过氧化物酶，室温30 min，用原位杂交用的PBS洗5 min×4次；在1ml蒸馏水加DAB显色试剂盒中显色剂A、B和C各1滴，混匀，加至标本上，显色20 min，充分水洗；苏木素复染，充分水洗；酒精脱水，二甲苯透明，封片。
        1.2.4  实验图像的观察与分析  端粒酶-RNA原位杂交DAB显色呈棕黄色颗粒着色，胞浆明显。所有标本均在Motic Med 6.0数码医学图像分析系统内在200×的放大倍数下，每组6张切片，每个切片观察5个视野。记录阳性目标平均光密度，以阳性目标平均光密度为端粒酶-RNA的mRNA表达强度。
        1.2.5  统计学分析  计量资料用±s表示，用SPSS13.0统计软件进行分析。多组间差异的显著性分析用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较用Tamhane检验。
       2  结果
        LMPAB对Bel-7402人肝癌细胞端粒酶-RNA表达的影响见图1～7。
       3  讨论
        端粒是染色体末端的一段碱基对，其脱失是启动衰老的分子钟。端粒序列的复制依赖于端粒酶的作用，端粒酶是由RNA和蛋白质组成的复合物。端粒酶RNA是端粒酶的重要组成部分，是维持端粒酶活性的必须成分。端粒酶能够以自身为模板指导端粒的延长，在细胞衰老和永生化过程中起重要作用，一些药物以端粒酶为靶点，诱导肿瘤细胞的凋亡，最终达到治疗肿瘤的目的［5］。端粒酶已在大多数肿瘤组织中检测到，如神经母细胞瘤（94%）、乳腺癌（93%）、肝癌（85%）、胃癌（85%）、前列腺癌（84%）、肺癌（80%）和肺小细胞癌（76%）等，而在邻近的正常人体组织细胞或良性肿瘤组织中多为阴性，或仅为活性较低的表达［6］。既然端粒酶特异性地表达于各种肿瘤细胞，又是肿瘤细胞无限增殖所必需，而且目前认为端粒酶活性增高可能是细胞通向癌变的最后的唯一旁路，那么如果能抑制肿瘤细胞端粒酶的活性，则这些肿瘤细胞就会因为端粒缩短而静止以致死亡。由于端粒特异性地表达于绝大多数肿瘤细胞，又是肿瘤细胞无限增殖所必需，因此开发针对端粒酶的抗肿瘤药物成为近年来肿瘤治疗学研究热点。姚金凤等［7］研究发现黄芪多糖通过降低HL-60细胞端粒酶活性而促进了肿瘤细胞凋亡。
        姬松茸又名小松菇、柏氏蘑菇和巴西蘑菇，是一种药食兼用的真菌。1965年，日裔巴西人将这种美味食用菌引入日本并取名为姬松茸。1992年，我国福建省农科院引进了该菌种，姬松茸在日本被作为恶性肿瘤化疗药物的辅助治疗品种［8］。众多研究表明，姬松茸子实体、菌丝体、提取物和发酵液都具有一定的抗癌功效［9］。我们将姬松茸子实体经水提、醇沉、脱蛋白和层析纯化得分子量为48 000 的多糖，经结构分析发现其主体结构为β-(1→3)-D葡聚糖，对其生物活性的研究表明10 μg·ml-1该多糖对k562细胞有直接细胞毒作用［4］。
        本研究结果表明，与空白对照组比较，LMPAB各剂量组（5，10，20 μg·ml-1）端粒酶-RNA mRNA表达下调，差异具有显著性（P＜0.01），并呈剂量依赖性，表明LMPAB具有下调端粒酶-RNA mRNA表达作用。LMPAB有可能通过抑制端粒酶端粒酶-RNA mRNA的表达，抑制肿瘤细胞生长，从而发挥抗癌作用。
       【参考文献】
         ［1］ Leuenroth S, Riethdorf S, Erbersdobler A, et al. Detection of human telomerase RNA in the tumour-surrounding mucosa of bladder carcinomas as a marker for premalignant transformation［J］.BJU Int, 2005, 96(4)：553.
       
       ［2］ 孟智强，宋明志，黄雯霞，等. 多种药物对肝癌细胞端粒酶活性的影响［J］.癌症，2000，19（4）：317.
       
       ［3］ 张华芳，金京顺，俞朝阳，等. 羊栖菜多糖诱导肿瘤细胞凋亡的实验研究［J］.时珍国医国药，2006，17（7）：1124.
       
       ［4］ 刘吉成，孙建宁. 低分子量姬松茸多糖提取分离及抗肿瘤活性筛选研究［J］. 中华中医药杂志， 2006，21（5）：190.
       
       ［5］ Harley CB. Telomerase and cancer therapeutics［J］.Nat Rev Cancer, 2008, 8 (3): 167.
       
       ［6］ Chang JY. Telomerase: a potential molecular marker and therapeutic target for cancer［J］.J Surg Oncol, 2004, 87(1): 1.
       
       ［7］ 姚金凤，吴春丽，陈慧霞，等. 黄芪多糖对HL-60细胞端粒酶活性的作用［J］.河南肿瘤学杂志，2005，18（4）：247.
       
       ［8］ Firenzuoli F, Gori L, Lombardo G. The Medicinal Mushroom Agaricus blazei Murrill: Review of Literature and Pharmaco-Toxicological Problems［J］.Evid Based Complement Alternat Med, 2008, 5 (1)：3.
       
       ［9］ Akiyama H, Kondo K. Agaritine and phenylhydrazine derivatives in Agaricus bisporus and Agaricus blazei Murrill［J］.Shokuhin Eiseigaku Zasshi, 2007, 48 (6): 397.