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       【摘要】 
       目的建立妇科养坤丸的质量标准，以更好控制产品质量。方法采用薄层色谱（TLC）法鉴别黄芩、木香、延胡索、甘草，以HPLC法测定黄芩苷的含量。结果TLC法可检出黄芩、木香、延胡索、甘草，斑点清晰，阴性对照无干扰，专属性强。黄芩苷在0.0576～1.44 μg范围内线性良好(r=0.999 9)，平均加样回收率为97.85%，RSD为0.86%。结论实验方法定性、定量方法简便、可靠、准确，可用于妇科养坤丸的质量控制。
       【关键词】  妇科养坤丸 黄芩苷 薄层色谱 高效液相色谱
       Study on the Quality Standard of Fukeyangkun Pills
       JIANG Hua, HUANG Song, TAO Yan, WANG Dehang
        
       1.Shenzhen Tsumura Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen 518103, China;
        
       2. Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China
       Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard for Fukeyangkun Pills. MethodsRadix Scutellaria，Radix Aucklandiae，Rhizoma Corydalis and Radix Glycyrrhizae in the pills were identified by TLC. Baicalin content was determined by HPLC.ResultsRadix Scutellaria，Radix Aucklandiae，Rhizoma Corydalis and Radix Glycyrrhizae could be identified by TLC, the spots were clear with non-interference. The baicalin content could be determined by HPLC. The quantitative method of baicalin showed a good linearity in the range of 0.0576μg～1.44μg. The average recovery of Baicalin was 97.85%，and RSD was 0.86%，respectively. ConclusionThe method is simple，reliable，accurate and can be used for the quality control of Fukeyangkun Pills.
       Key words：Fukeyangkun Pills;  Baicalin;  TLC;  HPLC
       妇科养坤丸由熟地黄、黄芩、木香、延胡索、香附、甘草、白芍、砂仁等14味药制成，具有疏肝理气，养血活血的功效。用于血虚肝郁而致月经不调，闭经，痛经，经期头痛等症。妇科养坤丸为部颁标准收载品种，标准编号为WS3-B-0081-89，原标准中只对其显微特征进行了鉴别。为了更好的控制产品的质量，本文采用HPLC对黄芩苷进行含量测定，并对黄芩、木香、延胡索、甘草进行薄层鉴别。以期为更好的控制妇科养坤丸的质量提供一种简便、可行、重复性好的质量控制方法，以保证临床疗效的稳定性。
       1  器材
       1.1  仪器
       Dionex Summit高效液相色谱仪(P680 HPLC Pump, ASI-100 Automated Sampled Injector,PDA-100 Phtodiode Array Detecter，STH585 Column Oven) Chromeleon数据处理系统；赛多利斯万分之一电子天平（德国）；电子数控式恒温水浴锅（江苏昆山医用设备厂）；硅胶G，硅胶GF254（青岛海洋化工厂生产）。
       1.2  样品与试药
       妇科养坤丸：自制(批号050825，050903，050920)；去氢木香内酯对照品（供薄层鉴别用，批号111525-200404）；延胡索乙素对照品（供薄层鉴别用，批号110726-200409）；甘草次酸对照品（供薄层鉴别用，批号110723-200411），黄芩苷对照品（供含量测定用，批号110715-200514）均由中国药品生物制品检定所提供；甲醇为色谱纯；水为超纯水，其他化学试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  薄层鉴别
       2.1.1  黄芩的薄层鉴别取本品11 g，研细，加醋酸乙酯-甲醇（3∶1）30 ml，回流30 min，滤过，蒸干，加5 ml甲醇，取上清液作为供试品溶液。取去黄芩的模拟处方，按供试品溶液的制备方法，依法制备阴性对照品溶液。取黄芩苷对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各6 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水-甲醇（5∶3∶0.6∶1.5∶0.8）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铁试液，日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。结果见图1。
       2.1.2  木香的薄层鉴别取本品6 g，研细，加氯仿10 ml，超声处理30 min，滤过，滤液作为供试品溶液。取去木香的模拟处方，按供试品溶液的制备方法，依法制备阴性对照品溶液。取去氢木香内酯对照品，分别加氯仿制成每毫升含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液和对照品溶液各5 μl，分别点于同一羧甲基纤维钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚-乙醚（5∶3.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％香醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。结果见图2。
       2.1.3  延胡索的薄层鉴别取本品11 g，研细，加甲醇50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 ml溶解，加浓氨试液调至碱性（pH9～10），用乙醚提取3次，10 ml/次，合并乙醚液，用稀硫酸溶液提取3次，10 ml/次，合并稀硫酸液，加氢氧化钠试液调至碱性（pH11～12），再用乙醚提取3次，10 ml/次，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。取去延胡索的模拟处方，按供试品溶液的制备方法，依法制备阴性对照品溶液。取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液与阴性对照溶液各10 μl，对照品溶液2 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-正丁醇-浓氨水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.8）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm） 下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的暗黄色荧光斑点。阴性对照无干扰。结果见图3。
       2.1.4  甘草的薄层鉴别取本品水蜜丸11 g，研细，或大蜜丸18 g，剪碎，加硅藻土12 g，研匀，加乙醚60 ml，加热回流1 h，滤过，药渣加甲醇40 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水40 ml使溶解，用正丁醇提取3 次，20 ml/次，合并正丁醇液，用水洗涤3次，蒸干，残渣加入盐酸5 ml，再加氯仿50 ml超声提取30 min，滤过，取氯仿提取液，蒸干，残渣加甲醇2 ml溶解，作为供试品溶液。取甘草次酸对照品，加甲醇制成每毫升含2 mg的溶液，作为对照品溶液。取缺甘草的其它药材制成的蜜丸18 g，同法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法［1］试验，吸取上述三种溶液各1～2μl，分别点于同一羧甲基纤维钠为黏合剂的硅胶GF254薄层板上，以石油醚-醋酸乙酯-冰醋酸 （25∶9∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。结果见图4。
       2.2  黄芩苷的含量测定
       2.2.1  色谱条件与系统适用性实验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为Agillent C18 ( 250 mm ×4. 6 mm， 5 μm)；流动相为甲醇－0.1%磷酸溶液 (47：53)；检测波长为280 nm；流速1.0 ml·min-1；柱温25℃。理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于2 500。
       2.2.2  对照品溶液的制备精密称取在60℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含60 μg 的溶液，即得。
       2.2.3  供试品溶液的制备取本品10 g，研碎，取约0.5 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，加70％乙醇50 ml，精密称定，超声提取（150W，35 kHz）30 min，放冷，精密称定，以70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
       2.2.4  专属性实验按处方比例和工艺，同法制成全方缺黄芩的的阴性对照液，按样品供试液的制备方法制备，测定。表明:在与黄芩苷对照品色谱的相应位置上无干扰峰出现，说明方中其它成分对测定结果无影响。黄芩苷对照品、供试品和阴性对照品的HPLC图谱见图5。
       2.2.5  线性关系考察取黄芩苷对照品溶液（0.060 mg/ml）自动进样1，5，10，15，20，25 μl，按上述色谱条件设定峰面积，以峰面积（Y, mAu*sec）对进样量（X，μg）进行线性回归，得回归方程为Y= 2 220.2 X- 0.629 4， r=0.999 9；表明黄芩苷在0.057 6～1.44 μg内线性关系良好。
       2.2.6  精密度实验取黄芩苷对照品溶液（0.060 mg/ml），重复进样6次，10 μl/次，按上述条件测得峰面积，RSD＝0.36%，表明精密度符合要求。
       2.2.7  稳定性实验取对照品溶液和供试品溶液分别于0，2，4，8及12 h，各自动进样6 μl，按上述色谱条件测定峰面积，对照品溶液和供试品溶液的RSD分别为0.87%，1.14%。表明12 h内对照品和供试品均稳定。
       2.2.8  重复性实验按上述的含量测定方法，对同一批样品（批号：050825）制备供试液，平行做5份，测得峰面积，计算含量，结果RSD＝1.18%，表明重复性良好。
       2.2.9  加样回收率实验精密称取已知含量的同一批样品(批号050825)6份，精密加入对照品适量，挥干溶剂，按供试品溶液制备项下操作。按色谱条件测定峰面积，计算回收率。结果见表1。表1  加样回收率实验结果（略）
       2.2.10  样品的测定取3批样品按含量测定项下的方法提取、测定并计算含量，每份样品测定3次取均值。结果见表2。表2  样品测定结果（略）
       3  讨论［2,3］
       黄芩苷为多酚羟基黄酮苷类化合物，采用70％回流提取转移率较高，但杂质较多，经比较，结果表明采用醋酸乙酯－甲醇（3∶1）回流提取，可显著减少水溶性杂质的溶出；提取样品含有较多脂溶性成分，在薄层上容易过载形成拖尾，影响鉴别，经实验，蒸干提取溶剂后的残渣采用乙醚振摇提取可很好的去除大部分杂质，黄芩苷基本无损失，乙醚不溶部分采用甲醇溶解，可获得较好的重复性。甘草中甘草酸的稳定性较差，研究采用将甘草酸水解成甘草次酸进行鉴别，可获得较好的重复性。
       本品中黄芩仅占全方药材不足10%，因此理论溶媒用量较《中国药典》为大；采用甲醇或乙醇提取可显著降低杂质提取量，有利于保护色谱柱，故本次实验分别对70％乙醇、无水乙醇、甲醇等提取溶媒的超声提取30 min，1，2 h和回流提取2，3，4 h进行了考察，结果显示采用70％乙醇超声30 min提取效果最好，操作简单、快速。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2000：附录VIB.
       
       ［2］陈锦容.妇科十味片的薄层色谱鉴别［J］.中华临床医药，2003，4（23）：115.
       
       ［3］白志川，于 杰，刘 圆.中药复方中的甘草和红花的薄层色谱定性鉴别［J］.西南农业大学学报（自然科学版），2004，26（5）：629.