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       【摘要】 
       目的探讨人巨细胞病毒(human cytomeglavirus,HCMV)对造血干细胞的增殖和分化情况的影响。方法采用造血干细胞体外培养技术,研究HCMV -AD169株对脐血造血干细胞增殖和分化情况的影响,采用PCR技术检测干细胞中的HCMV DNA.。结果HCMV 在体外能明显抑制造血干细胞的增殖和分化,抑制程度随病毒浓度的升高而增大,经PCR检测病毒感染的细胞中有HCMV DNA的存在。结论HCMV-AD169对造血干细胞增殖和分化情况的有抑制作用。
       【关键词】  巨细胞病毒 造血干细胞 增殖 分化
       Effect of Cytomeglavirus on Proliferation and Differentiation of Hematopoietic Stem Cell
       ZHAO Xiurong， ZHANG Fengying, ZHAO Lianzhi, MI Shubin, WANG Qinglin
       1.Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000,China;
       2. Medical School of Human Narmal University, Changsha 410006, China
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of  human cytomeglavirus（HCMV） on proliferation and differentiation of hematopoietic stem cell（HSC）. MethodsThe technology of  cell culture was used to observe the effect of HCMV-169 strain on proliferation and differentiation of hematopoietic stem cell, and the technology of polymerase chain reaction(PCR) was used to detect the existence of HCMV DNA in HSC. ResultsHCMV AD169 suppressed the proliferation and differentiation of HSC in a dose-dependent manner. HCMV was successfully detected in HSC.ConclusionHCMV AD169 strain can suppress the proliferation and differentiation of HSC.
       Key words：Cytomeglavirus;  Hematopoietic stem cell;  Proliferation;  Differentiation
       人巨细胞病毒(Human cytomeglavirus,HCMV)感染非常普遍,人是HCMV的唯一储存库,HCMV原发感染后以潜伏状态持续存在，在某些特殊条件下可以被激活，而引起造血功能紊乱，表现为骨髓抑制、血小板减少、粒细胞减少、单核细胞增多症、贫血、肝脾肿大和免疫功能紊乱等［1］。我们采用造血干细胞体外培养技术研究HCMV-AD169对脐血造血干细胞的影响,用聚合酶链反应(PCR)法检测细胞内HCMV DNA,以探讨HCMV对造血干细胞的作用。
       1  材料与方法
       1.1  材料
       脐血标本均来自于附属医院及妇幼保健院，病毒株HCMV-AD169株由湖南师范大学提供，造血干细胞免疫磁珠分离试剂盒购于宁波新芝科技有限公司，DMEM及IMDM培养基购于GIBCOBRL公司。
       1.2  方法
       1.2.1  脐血单个核细胞［2］及CD+34细胞的分离 
       无菌法采集健康新生儿脐血,用DMEM培养液按1:1稀释,混匀后用吸管沿管壁缓慢叠加于淋巴分离液面上,水平离心2 000 r/min，30 min，在上、中层界面处有一白色云雾层狭窄带仔细吸取单个核细胞，用5倍体积的DMEM培养液洗涤,1 500 r/min离心10 min，重复两次。细胞沉淀用DMEM均匀配成单个核细胞悬液并记数。通过造血干细胞免疫磁珠分离系统分离CD+34细胞。
       1.2.2  感染方式及分组 
       采用持续性感染方式，即HCMV直接加入到培养体系中混合培养。实验分对照组两组，分别是①空白对照组:不加HCMV病毒液，加入同体积的IMDM；②灭活对照组：加入同体积灭活HCMV病毒液（病毒液在紫外灯下照射15 min灭活）；感染组分3组即1∶10，1∶100，1∶1 000；分别直接加入0.1 ml的1∶10，1∶100，1∶1 000的HCMV-AD169DNA株病毒液与细胞混合培养。
       1.2.3  细胞培养将上步收集的细胞进行培养，按106/ml  CD+34细胞密度培养，1 ml体系中含有12.5%胎血清、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素，IL-3，SCF各100 ng/ml，5×10-7/ml氢化可的松，余体积用IMDM补充。培养于24孔板，每孔1 ml，37℃培养于50 mmol/L CO2及饱和湿度的培养箱中。每3 d半量换液1次，在培养5，10，15，20 d和30 d时，用血细胞记数板分别计数细胞的增殖情况，染色后镜下观察细胞的分化情况。
       1.2.4  应用PCR技术检测造血干细胞中的HCMV-AD169DNA  取上述培养液低速离心沉淀细胞弃上清液，用磷酸盐缓冲液低速离心洗涤2次，再用双蒸水洗1次，弃上清液，以去除细胞外残留病毒，提取DNA按PCR试剂盒说明书进行，在紫外灯下观察，有无特异的阳性扩增带。
       1.2.5  统计学分析
       各组属数值型资料，应用sas软件方差分析和q检验。
       2  结果
       2.1  造血干细胞形态及增殖和分化情况的影响
       观察:两对照组中使用的培养体系质量稳定，细胞生长良好，培养21 d以后，台盼蓝活体染色细胞存活率>98%。病毒感染组正常细胞数目明显减少，并出现形态学异常，经Winght-Giemsa染色，观察可见一些细胞体积增大，包膜不完整，胞核大，折光性强。增殖情况见表1。表1  细胞增殖数目的组间比较(略)
       2.2  干细胞内HCMV-AD169DNA检测
       采用普通PCR技术检测5组细胞内HCMV-AD169DNA,在3个滴度病毒感染组均出现特异扩增带,空白对照组和灭活对照组无阳性扩增带。
       方差分析：多组间有统计学意义(F=31.51,P<0.01),两两比较进行q检验:感染组与对照组间、感染组间均有统计学意义(P<0.05)
       3  讨论
       人群中HCMV感染较为常见［3，4］，已有学者研究发现HCMV感染可伴随有血小板和粒细胞减少等造血系统异常的表现［5，6］但并未引起重视，后来一些学者证实，HCMV抑制机体晚期的造血作用，但HCMV是否直接感染早期造血细胞未见报道，本实验前，脐血标本经严格的检测，未检测到HCMV-DNA，本实验采用病毒直接感染细胞的混合培养的方法,用不同浓度的巨细胞病毒HCMV-AD169体外培养感染人脐血造血干细胞，结果显示对脐血造血干细胞的增殖和分化有明显的抑制作用。
       实验采用PCR检测技术检测干细胞中的HCMV-DNA的结果在各培养体系中HCMV感染组均能检测到相应的阳性扩增带，表明干细胞可能是HCMV潜伏的最主要细胞之一,HCMV-AD169株能直接感染脐血造血干细胞抑制其增殖和分化,这与临床上出现的造血功能紊乱可能有关。
       【参考文献】
         　　［1］Crapnell K，zanjani ED，Chaudhuri A，et al.In vitro infection of megakaryocytes and their precursors by human cytomegalovirus［J］. Blood, 2000,95(2):487.
       
       ［2］金伯泉.细胞和分子免疫学实验技术［M］.西安：第四军医大学出版社，2002：61.
       
       ［3］Minton EJ,Tysoe C,Sindair JH,et al.Human cytomega lovrus infection of the monocyte/macrophage lineage in bone marrow［J］. J Virol,1994,68:4017.
       
       ［4］Dejong MD，Galasso GL，Gazzard B，et al.Summary of the international symposium on cytomegalovirus［J］. Antiviral Res,1998,39(3):141.
       
       ［5］Mizutani K,Azuma E,Komada Y,et al.An intantilen case of cytomegalovirus induced idiopathic thrombocytopentic purura with predominant prolifcration of CD10 positive lymphoblast in bone marrow［J］. Acta paediatr Jpn,1995,37:71.
       
       ［6］ZHAN P,LIU B,LIU WT,et al.Effect of human cytomegalovirus on proliferation of multipotenital hematopoietic progenitors and intervention study in vitro［J］. China Journal of Modern Medicine,2005,15(2)：182.