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       【摘要】 
       目的探讨肿瘤坏死因子α（TNF-α）在支气管扩张症发病机制中的作用及支扩宁合剂的疗效机理。方法应用支气管扩张症患者痰液刺激分组体外培养的人支气管上皮细胞，检测、分析各组细胞TNF-α表达水平及中药支扩宁合剂的干预效果。结果在支气管扩张症患者的痰液刺激下，支气管上皮细胞TNF-α表达活化；中药支扩宁合剂可抑制支气管上皮细胞TNF-α的表达。结论支气管上皮细胞TNF-α表达在支气管扩张症发病中可能起到重要的作用；中药支扩宁合剂可抑制支气管上皮细胞TNF-α的表达，从而抑制支气管扩张症气道炎症反应，这可能是其疗效机理之一。
       【关键词】  支扩宁合剂 支气管扩张症 支气管上皮细胞 肿瘤坏死因子-α
       Effect of Zhikuoning Mixture on Expression of TNF-α in Human Bronchial Epithelial Cells in vitro Study
       WU Qibiao, CAO Shihong, LU Jinfu, DA Qingguo，SUN Zikai
       1.Macau University of Science and Technology, Macao,China；
       2.Nanjing University of Chinese Medicine, Jiangsu Nanjing 210029,China；
       3.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Jiangsu Nanjing 210029,China
       Abstract：ObjectiveTo explore the role of TNF-α in the pathogenesis of bronchiectasis and the mechanism of therapeutical effiect of Zhikuoning Mixture on bronchiectasis.MethodsIn vitro cultured Human Bronchial Epithelial Cells(HBE) were divided into groups and stimulated by sputa from bronchiectatic patients.The expression of TNF-α in HBE and the effect of Zhikuoning Mixture on it were assessed. ResultsThe expression of TNF-α in HBE was activated by sputa from bronchiectatic patients and Zhikuoning Mixture might suppress the expression. ConclusionThe expression of TNF-α in HBE plays an important role in the pathogenesis of bronchiectasis; Zhikuoning Mixture can suppress the TNF-α expression in HBE so as to improve airway inflammation in bronchiectasis. This may be one of mechanisms of therapeutic effect of Zhikuoning Mixture on bronchiectasis.
       Key words：Zhikuoning mixture;  Bronchiectasis;   Human bronchial epithelial cells;   TNF-α
       慢性炎症持续进展导致支气管树及其周围肺实质破坏，是发生支气管扩张症（简称支扩）及其相关症状的一个主要原因。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）具有广泛生物学功能，在支扩发病中发挥着重要的作用［1］。
        本实验从体外研究角度，探讨了TNF-α在支扩发病中的作用及中药支扩宁合剂的干预效应。报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1  人支气管上皮细胞株HBE 4-E6/E7-C1（以下简称HBE），购于American Type Culture Collection USA，产品编号CRL- 2079，F-11778，上海晶赛生物工程有限公司代购。
       1.2  培养基含
       20% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基。
       1.3  药物
       1.3.1  支扩宁合剂 
       500 ml(0.7 g/ml)，为中药复方制剂，由南京中医药大学附院制剂室提供。处方：黄芩 10 g，桑白皮 10 g，杏仁 10 g，枳壳 10 g，郁金 10 g，南沙参 10 g，麦冬 10 g，薏苡仁 15 g，冬瓜仁 15 g，全瓜蒌 15 g，黛蛤散 15 g，丹参 15 g，白茅根 30 g，等。分别按终浓度 7×10-3，7×10-4，7×10-5 g/ml 稀释备用。
       1.3.2  红霉素 
       0.3g/支，大连美罗大药厂生产，批号 20050503。根据文献［2］，按终浓度 5 μg/ml  计算，用培养基稀释成 25 μg/ml 备用。
       1.4  刺激物 
       取自支气管扩张症急性感染期患者。患者为首次就诊，未作任何治疗，清洁口腔后，咯出黏液脓性痰液，取 3.5 ml ，高速冷冻离心（4℃，23 000 r/min，90 min），取上清液约2.8 ml ，置于-80℃ 冻存备用，取用时按终浓度 25，50，100 倍稀释。
       1.5  试剂
       1.5.1  D-Hanks液称取
       KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4·12H2O 0.08 g，溶于三蒸水中，混合均匀，定容至1 000 ml，调节pH值至7.0～7.4，高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存。
       1.5.2  消化液 
       取 0.25 g 胰蛋白酶粉末，0.03 g 乙二胺四乙酸（EDTA），以少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks液定容至100 ml，混匀，放置冰箱内过夜，滤纸过滤后，0.22 μm微孔滤膜过滤，分装，即得0.25%胰蛋白酶与0.03% EDTA混合溶液，4℃保存备用。
       1.5.3  人TNF-α ELISA试剂盒晶美生物工程有限公司，批号 EA120611。
       1.6  仪器 
       CO2培养箱，型号：5410，Precision Scientific生产。高速冷冻离心机，型号：CP 80 MX，日本日立工机株式会社生产。倒置显微镜，型号：XSZ-D2，重庆光学仪器厂生产。超净工作台，苏州净化设备有限公司。
       2  方法
       2.1  细胞培养 
       人支气管上皮细胞株置于 25 ml  培养瓶中培养，培养条件为：含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃，5%CO2培养箱。传代2次/周，采用消化法传代。
       2.2  分组、条件培养及测定TNF-α表达 
       2.2.1  分组、条件培养
       于 24 孔培养板中培养72 h 后加入药物，再继续孵育36 h，加入刺激物孵育4 h 收取上清做 ELISA 测定。技术路线、实验方案见图1。
       根据文献报道［3］，选用 50 倍稀释痰液作为刺激物，观察各组 TNF-α表达情况。另外，为观察不同浓度刺激物对 TNF-α表达的影响，设不同浓度（终浓度100倍，25倍稀释）刺激物对照组。分组如下：
       A组（支扩宁大剂量组）：HBE+培养基+支扩宁（5×10-3 g/ml）+50倍稀释刺激物；
       B组（支扩宁中剂量组）：HBE+培养基+支扩宁（5×10-4 g/ml）+50倍稀释刺激物；
       C组（支扩宁小剂量组）：HBE+培养基+支扩宁（5×10-5 g/ml）+50倍稀释刺激物；
       D组（阳性药物对照组）：HBE+培养基+红霉素+50倍稀释刺激物；
       E组（HBE-刺激物对照组)：HBE+培养基+50倍稀释刺激物；
       F组（HBE对照组)：HBE+培养基；
       G组（刺激物对照组)：培养基+50倍稀释刺激物；
       H组（HBE-100倍稀释刺激物对照组)：HBE+培养基+100倍稀释刺激物；
       I组（100倍稀释刺激物对照组)：培养基+100倍稀释刺激物；
       J组（HBE-25倍稀刺激物对照组)：HBE+培养基+25倍稀释刺激物；
       K组（25倍稀刺激物对照组)：培养基+25倍稀释刺激物。
       2.2.2  TNF-α表达测定
       采用双抗体夹心ELISA法。
       2.3  统计学处理 
       计量数据采用 SPSS13.0 for Windows 统计分析软件进行处理，所用数据以均数±s表示，采用方差分析和两两比较采用q检验（Student-Newman-Keuls）。
       3  结果
       如表1所示，E，H，J组与F组比较，TNF-α水平增高，差异有显著性(P＜0.05)或非常显著性(P＜0.01)；H组与E组，E组与J组比较，TNF-α差异有显著性(P＜0.05)，说明HBE在与不同浓度刺激物孵育 36h 后，表达 TNF-α增强，并且刺激物浓度越高，表达越强。
       A，B，C，D组与E组比较，差异有显著性(P＜0.05)或非常显著性(P＜0.01)，说明支扩宁各剂量组、阳性药物对照组均可降低HBE表达TNF-α的水平；A组与B组， B组与C组比较，差异有显著性(P＜0.05)，说明支扩宁浓度越高，抑制HBE表达TNF-α的作用越强；C组与D组比较，差异无显著性(P＞0.05)，表明小剂量支扩宁与阳性药物（5 μg/ml）的抑制作用相当。表2  各组TNF-α测定结果（略）
       4  讨论
       支扩主要临床表现为慢性咳嗽、咯脓痰、咯血等，属中医学“咳嗽”“咯血”“肺痈”等范畴。
       曹世宏教授从事肺科医、教、研三十余载，对支扩尤为擅治，创立“支扩宁合剂”，在临床应用中取得良好疗效。该方由《景岳全书》桑白皮汤、《统旨方》清金化痰汤演化而来。其中黄芩、桑白皮味苦气寒、清泻肺热；全瓜蒌、杏仁清热化痰、降气止咳；薏苡仁、冬瓜仁健脾益气、化痰利湿、清热排脓，两药配伍取大黄牡丹汤、苇茎汤之意；枳壳、郁金理气宽胸、解郁行滞；白茅根、丹参清热凉血、活血化瘀；黛蛤散清肺化痰、凉肝止血。诸药合用共奏清热化痰、凉血行瘀、养阴润肺之功。
       TNF-α主要由气道上皮细胞和巨噬细胞分泌产生，可激活血管内皮细胞，使循环中的中性粒细胞黏附启动，并可作用于核因子-κB激活其转录，促进致炎性细胞因子和炎症介质的释放，导致支扩炎症发生发展［3～5］。
       研究结果表明，在支扩患者痰液刺激下，支气管上皮细胞TNF-α表达增强，显示支气管上皮细胞表达致炎性细胞因子TNF-α在支扩发病进程中可能扮演重要作用。同时，本研究也证实支扩宁合剂可抑制支气管上皮细胞TNF-α表达，从而抑制支扩气道的炎症反应，这可能是其疗效机理之一。
       从影响气道炎症、细胞因子出发深入探讨中医药治疗支扩的作用及其机制，有可能成为新的切入点，值得进一步深入探讨。
       【参考文献】
         　　［1］吴其标,邢扬扬,曹世宏.支气管扩张症发病机制的若干研究进展［J］.临床荟萃,2006,21(2):139.
       
       ［2］何志义,邹朝霞,刘启才,等.红霉素对支气管上皮细胞转录因子核因子κＢ、启动蛋白1活性的影响［J］.中华结核和呼吸杂志,2004,27(9):637.
       
       ［3］Ho JC,Tipoe G,Zheng L. In vitro study of regulation of IL-6 production in bronchiectasis［J］. Respir Med,2004,98(4):334.
       
       ［4］Takizawa H.Airway epithelial cells as regulators of airway inflammation［J］.Int J Mol Med. 1998,1(2):367.
       
       ［5］吴其标,曹世宏,卢金福,等.支扩宁合剂对人支气管上皮细胞NF-κB表达影响的体外研究［J］.澳门科技大学学报,2007,1:36.