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       【摘要】 
       目的利用AB8大孔吸附树脂纯化黄连、关黄柏中季铵总碱,确定树脂纯化季铵总碱的工艺参数。方法以季铵总碱和盐酸小檗碱吸附量为指标，并通过正交实验考察确定了该树脂分离纯化季铵总碱的工艺条件。结果AB8 型树脂对季铵总碱有良好吸附分离性能,其吸附分离季铵总碱的工艺条件为：上样浓度为50 mg/ml（生药量），上样液pH值为8，吸附流速为3BV/h ,上样体积为5BV，洗脱剂为5倍量树脂柱体积50%乙醇。结论AB8 型大孔吸附树脂在所确定的工艺条件下,纯化季铵总碱效果良好，季铵总碱的纯度可达90%。
       【关键词】  季铵总碱 大孔吸附树脂 纯化
       Research on the Purification of Total Quaternary Ammonium Hydroxide of Coptis chinensis Franch.and Phellohendron amurense Rupr.by AB8 Macroporous Resin
       REN Xiaofeng , YU Tingting , CHEN Jun
       （Shool of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212013, China)
       Abstract：ObjectiveTo set up a method for purification of total quaternary ammonium hydroxide from Coptis chinensis Franch.and Phellohendron amurense Rupr.by AB-8 macroporous resin . Methods The technical process for purification of total quaternary ammonium based on AB-8 macroporous resin was selected by dynamic absorption ratio through orthogonal tests.ResultsThe AB - 8 macroporous resin owned optimum absorption and elution ability.The optimum absorption conditions were that the sample concentration was 50mg ·ml-1， the PH of sample was at 8, the current velocity was 3BV ·h-1, the eluant was 50 % ethanol（5BV）.ConclusionThe AB - 8 macroporous resin can be used to purify total quaternary ammonium hydroxide successfully.The purity of total quaternary ammonium hydroxide is about 90 %.
       Key words：Total quaternary ammonium hydroxide;  Macroporous resin;  Purification
       黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.三角叶黄连 Coptis deltoidea C.Y. Cheng et Hsiao.或云连Coptis teeta Wall.的干燥根茎，其性寒味苦, 具有清热燥湿、泻火解毒的功效。关黄柏为芸香科植物黄檗Phellohendron amurense Rupr.的干燥树皮，其性寒味苦，具有清热燥湿、泻火除蒸、解毒疗疮的功效［1］。黄连、黄柏配伍使用，为中医常用“药对”之一，出自《伤寒论》白头翁汤，黄连燥湿清热，能泻一切有余之湿火，两药相须配对，相互协同以增强疗效［2］。现代药理也表明，黄连和关黄柏药用的主要有效成分为季铵型生物碱，主要有小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀等成分，具有抑菌、清热、解毒等作用，两药联合应用，其药力远较单味应用为强［3］。大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的新型吸附剂，是继离子交换树脂之后又一新兴的介质。近年来已广泛应用于天然植物中活性成分,如皂苷、黄酮、内脂、生物碱等大分子化合物的提取分离［4］。
       本实验以季铵总碱和盐酸小檗碱的含量为筛选指标对AB-8大孔吸附树脂纯化的工艺进行研究。
       1  仪器与试药
       1.1  仪器 
       JASCOLC-1500高效液相色谱仪；JASCOW-1575紫外检测器；Buchi R-200型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；METTLER AE240分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；紫外可见分光光度计；THZ-C摇床(江苏太仓市华美生化仪器厂)；Sartorius BP2112D 型电子天平(德国赛多利斯公司)；BUG25212 型超声波清洗机。
       1.2 试药 
       黄连、关黄柏药材(购自江苏省江扬国药有限公司)；盐酸小檗碱对照品(中国药品生物制品检定所提供)；树脂AB－8，S-8，NKA-9，X-5(南开大学化工厂)；高效液相用甲醇为色谱纯；高纯水；其它试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1   含量测定
       2.1.1  紫外分光光度法
       精密称取盐酸小檗碱3.6 mg，加水定容至50 ml。分别精密吸取标准溶液10，5，2.5 ml，定容至50 ml，为溶液A，B，C。分别精密吸取A溶液10，7.5，5 ml,定容至50 ml，为溶液D，E，F。精密吸取B液5ml，定容至50ml，为溶液G。精密吸取以上溶液及蒸馏水10.0 ml置带塞三角烧瓶中，加pH10缓冲液5.0 ml，加水33.0 ml，苦味酸钠2.0 ml，摇匀，超声波振荡20 min，精密加入二氯乙烷10.0 ml，振荡3 min，置分液漏斗内静置分层，以干燥滤纸滤过，按分光光度法（《中国药典》2005版Ⅰ部附录VA），以10.0 ml蒸馏水处理的溶液作为空白，于361 nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得回归方程：Y=0.082 9X-0.030 6, r=0.999 8，线性范围为0.72～14.40μg/ml，样品测定后按此回归方程计算。   
       2.1.2  高效液相色谱法 
       色谱条件：色谱柱为sinochrom C18（250 mm×4.6 mm ,5 μm) ；柱温40.0℃；流速1.0 ml/min;流动相为甲醇∶水(31∶69)，每1 000 ml水溶液含3.3 ml三乙胺和140 ml36%乙酸 ;测定波长365 nm；理论塔板数按盐酸小檗碱峰计算不低于2 500。标准曲线的制备：精密称取盐酸小檗碱对照品2.0 mg, 加甲醇定容至10 ml,摇匀，作为对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 ml至10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样20 μl，测定峰面积。以峰面积对进样量回归，得回归方程：Y=3 541 229.41X + 2 9 261.55，r=0.999 9(n=5)，线性范围为0.063 6～1.272 μg。样品测定后按此回归方程计算。
       2.1.3  上柱液的制备   称取黄连（60 g）、关黄柏(60 g)粗粉（20目）,加12倍量水回流提取3次,2 h/次,提取液滤过,合并,部分浓缩,加等量95%乙醇醇沉，静置过夜，离心20 min (5 000 r/min) ，取上清液，浓缩至无醇味，加水,60℃保温30 min，离心20 min (5 000 r/min)，加水定容到一定体积(相当于含生药量100 mg·ml-1)，即得上柱液。
       2.2   大孔吸附树脂选择
       2.2.1  大孔吸附树脂的预处理 
       100 g树脂（干重）加500 ml 4%氢氧化钠浸泡24 h，去离子水洗至pH中性，再加500 ml 95%乙醇60℃浸泡3 h，去离子水洗去乙醇至无醇味。
       2.2.2  静态吸附量考察 
       分别精密称取预处理过的大孔吸附树脂NKA-9 , S-8,AB-8, X-5各1 g（湿重）置于100 ml锥形瓶中,分别加入20 ml黄连、关黄柏提取溶液(含生药量100 mg·ml-1) ,室温下置摇床中于60 r/min下振摇24 h，使之充分吸附，取上清液测定其中季铵总碱的含量，计算各树脂的静态吸附量，结果见表1。
       静态吸附量(mg/g)=(上样液浓度- 吸附剩余液浓度)×上样液体积树脂质量
       2.2.3  静态解吸量考察
        
       取“2.2.1”项下已吸附过的树脂，分别加入70%乙醇20 ml，室温下置摇床中于60 r/min下振摇24 h，使之充分解吸，取上清液测定其中季铵总碱的含量，计算各树脂的静态解吸量,并根据静态吸附量计算解吸率。结果见表1。表1  不同类型的大孔吸附树脂对季铵总碱吸附效果的影响（略）
       静态解吸量(mg/g)=洗脱液浓度×洗脱液体积树脂质量
       
       解吸率（%）=静态吸附量/静态解吸量×100%
       2.2.4  大孔吸附树脂AB-8吸附动力学实验取经过预处理过的AB-8大孔吸附树脂1.00 g（湿重）,置于250 ml锥形瓶内，再加入0.1 g生药/ml浓度的供试液30 ml。锥形瓶置于恒温振荡器内，30℃下振荡24 h，使树脂充分吸附，根据吸附前后溶液中各成分浓度的差值，计算出吸附量。测定树脂在t 时刻 ( t= 0.5 ,1，2 ,3……6h)吸附量 (mg/g) ,得吸附动力学曲线。见图1。
       
       如图1可知：AB-8树脂对季铵总碱的吸附，随着时间的延长，吸附量增大，起始阶段吸附速率较大且2 h达到平衡，属于单分子层吸附。快速吸附在工业上是很有利的，可缩短生产周期。
       2.2.5  最大动态吸附量考察 
       精密称取AB-8树脂5 g (湿重) ,装柱,柱径高比为1∶10；柱体积约8 ml。徐徐注入含生药量为0.05 g/ml的黄连、关黄柏粗提液，上柱流速调节为4 BV/h ,分管收集流出液,每管10 ml，测定流出液中季铵总碱的含量［5］。得穿透曲线如图2。
       由图2可知随着时间的延长，流出液与上样液的浓度之比逐渐接近。AB-8树脂可以吸附40 ml粗提液（0.05 g生药/ml）中季铵总碱而基本不泄漏；上样量达到140 ml时，AB-8树脂对季铵总碱的吸附基本达到饱和。考虑到黄连、关黄柏为珍贵药材，本着节约的原则，选择上样量为40 ml（约5BV），以生药量计为2 g。表2  直观分析表（略）
       2.3  大孔树脂吸附条件的优化 
       为考察上样时样品溶液的浓度、上样液pH值、上样流速这3个条件对AB－8树脂吸附季铵总碱的影响［6］, 在预实验的基础上按L9(34)表进行了正交实验。精密称取AB-8树脂5g (湿重) ,装柱,柱径高比为1∶10，上样量为2 g黄连、关黄柏药材提取液，按表2的条件分别上样并计算对应的树脂的吸附量，实验结果及方差分析见表3～4。表3  季铵总碱方差分析（略）表4  盐酸小檗碱方差分析表（略）
       由表3～4可知,上样浓度、上样流速对季铵总碱和盐酸小檗碱的吸附量无显著性影响,上样液pH值对季铵总碱的吸附量有显著性影响，根据实验数据,最后确定最佳吸附条件为A2 B2C3，即上样浓度为50 mg/ml(生药量)，上样流速为3 BV/h，上样液的pH值为8。
       2.4  验证实验精密称取AB-8树脂5 g(湿重) ,装柱、柱径高比为1∶10，上样量为2 g，黄连、关黄柏药材提取液，按正交实验筛选出的条件上样，计算树脂的吸附量。结果见表4。表5  验证实验结果（略）
       由表4可知，根据正交实验筛选出的吸附条件进行动态吸附，树脂的吸附量较大。
       2.5   洗脱剂的选择  
       2.5.1  洗脱剂浓度的选择按“2.2.5”项中已吸附饱和的树脂,用不同浓度的乙醇进行动态洗脱,先用100 ml（12.5 BV）水洗脱,再依次用10%, 30%，50%，70%，95%乙醇各100 ml（12.5 BV） 洗脱,洗脱流速为3 BV/h,分段收集洗脱液,每管25 ml，约合3 BV,测定其中季铵总碱的含量。以流份序号为横坐标, 季铵总碱含量为纵坐标,绘制梯度洗脱曲线。    由图3得出，10%乙醇，30%乙醇，50%乙醇洗脱液中都含有季铵总碱，由于低浓度的乙醇洗脱液需要较大用量才能将所吸附的季铵总碱洗脱出来，因此选用50%乙醇为洗脱剂。
       2.5.2  洗脱剂用量的选择按“2.2.5”项中已吸附饱和的树脂，蒸馏水洗至流出液无色，以50%乙醇为洗脱剂，流速1 ml/min。洗脱液每10 ml收集一管，检测各管中季铵总碱的含量，以洗脱液体积为横坐标，洗脱液中季铵总碱浓度为纵坐标绘制洗脱曲线，由此确定洗脱剂用量。
       由图4可见，黄连、关黄柏提取液上柱后，50 ml(约6.25BV)的50%乙醇即可将树脂吸附的季铵总碱基本洗脱下来。
       
       2.6  大孔吸附树脂的再生 
       实验表明，经过预处理的AB-8树脂对季铵总碱的吸附率为80.30%，树脂使用后，用95%乙醇洗脱至无色时，然后以大量的纯化水洗去醇, 树脂柱即已再生，可进行下一次的吸附分离，其对季铵总碱的吸附率为79.96%。说明树脂再生能力较强。3  结论
       
       AB-8树脂孔容小，体积比表面积大(每毫升湿树脂所具有的比表面积m2/ml),吸附量较大。正交实验表明：黄连、关黄柏提取液浓度在50 mg/ml（生药量），pH为4，上样流速为4 BV/h 时吸附效果最好，饱和吸附量可达78.44 mg/g(湿重)，将洗脱液pH值调至8时，洗脱效果最好，样品纯度可达90%左右，回收率为68.44%。树脂可以再生利用，成本较低，生产周期较短，适宜大规模生产。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会. 中国药典，Ⅰ 部［S］.北京：化学工业出版社，2005：211.
       
       ［2］胥庆华.中药药对大全［M］.北京：中国中医药出版社，1996：132.
       
       ［3］朱坤杰，李 涛.小檗碱的药理研究及临床应用进展［J］.中国药业，2004，9（1）：22.
       
       ［4］刘瑞源， 钟 平.大孔吸附树脂提取中草药有效成分的研究进展［J］.时珍国医国药，2004，15（6）：2.
       
       ［5］李信炯，段木盛，徐学梅.离子对萃取法测定黄连中的季铵总碱含量［M］.中成药研究，1982，9：10.
       
       ［6］刘友平，鄢 丹.大孔吸附树脂纯化中药有效成分的影响因素［M］.中药新药与临床药理， 2003，14（3）：212.