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       【摘要】 
       目的研究提取常春油麻藤中总黄酮的最佳工艺条件。方法以芦丁为指标，用NaNO2- Al(NO3)3-NaOH显色体系作为显色剂，用正交实验法对常春油麻藤总黄酮提取方法进行了系统研究。结果最佳提取工艺为30倍量60%乙醇回流3次，40 min/次，常春油麻藤中总黄酮的含量为12.43%。结论乙醇浓度、料液比、回流时间和提取次数对常春油麻藤总黄酮的提取均有影响。最佳提取工艺为A2B3D1C1。
       【关键词】  常春油麻藤 总黄酮 芦丁 紫外分光光度法 正交实验
       Orthogonal Design on Extraction Technology of Total Flavonoids in Mucuna sempervirens Hemsl. by orthogonal design
       ZHANG Ling，LIU Yali，RAO Zhijun，FENG Jun
       (Key Laboratory of Ministry of Modern Preparation of TCM, Jiangxi Nanchang 330006，China)
       AbstractObjectiveTo study the optimum extraction technology of total flavonoids in Mucuna sempervirens Hemsl. MethodsUsing Rutin as the evaluating criteria and NaNO2- Al(NO3)3-NaOH as chromogenic agent, the extraction condition was studied by orthogonal test. ResultsThe optimum extraction technology was as follows：solid-liquid ratio 1：30, 60% ethanol, refluxing and extracting for 40 min, 3 times. The total flavonoids in Mucuna sempervirens Hemsl was 12.43%. ConclusionEthanol concentration, solid-liquid ratio, extraction time and number of times have significant impact on extraction of total flavonoids in Mucuna sempervirens Hemsl. The optimum extraction technology is A2B3D1C1.
       Key wordsMucuna sempervirens Hemsl.;  Total flavonoids;   Rutin;   UV;   Orthogonal design
       
       常春油麻藤，是丰城鸡血藤的一个品种，又名牛马藤或大血藤，是豆科植物常春油麻藤 Mucuna sempervirens Hemsl. 的藤茎。性温，味苦。具有行血活血、通经活络之功效，主治关节风湿痛、跌打损伤、血虚、月经不调及经闭。
       有文献报道，常春油麻藤中主要含有黄酮类成分，如刺芒柄花素、大豆黄素以及3,7-二羟基-6-甲氧基二氢黄酮等［1］。黄酮化合物具有降血糖、降血脂、抗菌消炎、抗氧化、抗衰老、消除体内自由基等药理作用。基于黄酮类化合物是其有效成分之一。因此，研究其定量方法，不仅对了解其中黄酮成分含量以观察药物的疗效与成分间关系具有一定意义，而且对控制生药质量，进一步制定其质量标准提供了依据。本文以提取物中总黄酮含量为指标，采用正交实验设计和紫外分光光度法对常春油麻藤中总黄酮的提取条件及含量测定进行了系统的研究，为进一步开发利用常春油麻藤及鸡血藤资源提供科学依据。
       1  器材
       1.1  仪器
       U-3000 Spectrophotometer(日本岛津公司)；电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）；SB3200超声波清洗仪（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DZF-6050型真空干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；X-9146MBE数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；HH-S数显恒温水浴锅（江苏省金坛市医疗仪器厂）；万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。
       1.2  材料与试剂
       芦丁对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：100080-200306）；常春油麻藤药材（采自于江西省南昌市湾里区梅岭山脉，由江西中医学院中药系赖学文老师采集并鉴定）；所用试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  总黄酮的测定方法
       2.1.1  测定方法
       依据在黄酮类化合物的紫外光谱图上主要有两个吸收带：环肉桂酰系统引起的吸收带Ⅰ（300～550 nm）和环苯酰系统引起的吸收带Ⅱ（240～280 nm）。若加入铝盐，则铝离子与黄酮化合物形成稳定的配合物，带Ⅱ会明显向长波方向移动（红移）；在NaNO2的强碱性溶液中，其在500～510 nm处吸光度值最大，从而为分光光度法测定提供了可靠的依据。
       2.1.2   测定方法
       取4个10 ml容量瓶，1，2号分别加入1 ml芦丁对照品溶液和1 ml稀释到一定倍数的常春油麻藤溶液，各加60%的乙醇稀释至刻度，以60%乙醇为空白，在紫外分光光度计上于200～760 nm波长范围内进行扫描。3，4号分别加入1 ml芦丁对照品溶液和1 ml稀释到与2号同样倍数的常春油麻藤溶液，加入0.15 ml 5% NaNO2溶液摇匀，放置6 min；加入0.15ml 10% Al(NO3)3溶液摇匀，放置6 min；加入4 ml 1 mol/L NaOH溶液摇匀，定容，放置0～15 min，用同样方法加入显色剂的溶剂作空白，在200～760 nm波长范围内扫描［2］，得出吸收光谱，结果见图1。
       从图1可以看出，在未加显色剂以前，对照品在361 nm和257 nm处有最大吸收，供试品在282 nm处有最大吸收，加入NaNO2- Al(NO3)3-NaOH显色体系后，对照品和供试品的吸收峰都发生了红移，在502 nm处有最大吸收。因此，可以确定502 nm为测定波长。
       2.1.3  对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品19.84 mg，置于50 ml容量瓶中，加60%乙醇溶解（如不溶，置水浴上微热并短时超声使之溶解），用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得芦丁对照品溶液（每毫升含芦丁0.992 mg）。
       2.1.4  标准曲线的制备精密量取芦丁对照品溶液0，0.2，0.5，1，1.2，1.5ml，分别置于10 ml容量瓶中，加60%乙醇至2 ml，然后按照“2.1.2”项中“加入0.5 ml 5%NaNO2 溶液”起，至“放置0～15 min”操作，以第一瓶溶液作空白，在502 nm测定各溶液的吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程：C=78.93A+0.201，相关系数：r=0.999 7。数据见表1，标准曲线见图2。表1  标准曲线测定数据（略）
       2.1.5   供试品溶液的制备取常春油麻藤粉末约0.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚适量，加热回流至提取液无色，弃去乙醚提取液。待乙醚挥干后，将粉末置干燥箱中60℃干燥约1 h,然后全部转移至150 ml烧瓶中，并按正交实验设计表中的因素和水平，精密加入规定浓度的乙醇，回流提取，滤过，合并滤液，置水浴上挥干，并转移至25 ml容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得。
       精密量取各份溶液2 ml，稀释到10 ml容量瓶，从稀释液中量取1 ml至10 ml容量瓶，按照“2.1.2”项中“加入0.5ml 5%NaNO2 溶液”起，至“放置0～15 min”操作，用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白，测定吸收度，由回归方程换算成总黄酮浓度。
       2.1.6  稳定性实验精密吸取对照品溶液和稀释5倍后的供试品溶液各1 ml，分别按照“2.1.2”中“加入0.15 ml 5%NaNO2 溶液”起，至“加入4 ml 1 mol/L NaOH溶液摇匀，定容”操作，用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白，分别在2，5，15，30，45，60 min测定吸收度，结果表明，对照品吸收度RSD＝0.41%(n=6)，样品吸收度RSD=1.09%,说明稳定性良好。数据见表2。表2  稳定性实验（略）
       2.1.7  精密度实验精密吸取同一份对照品和稀释5倍后的供试品溶液各5份，每份1 ml，按照“2.1.2”中“加入0.5 ml 5%NaNO2 溶液”起，至“放置0～15 min”操作，用以同样方法加入显色剂的溶剂作空白，测定吸收度，结果表明，对照品吸收度RSD＝0.66%（n＝5），样品吸收度RSD＝0.83%(n=5)，说明精密度良好。数据见表3。2.1.8  重复性实验取同一份常春油麻藤样品细粉5份，然后按照“供试品溶液的制备”项下操作，测定样品加入显色剂15 min内在502 nm波长下的吸收度，结果表明，5次测定的平均含量为12.22%，RSD＝1.15%，说明重复性良好。数据见表4。表3  精密度实验（略）表4  重复性实验（略）
       2.1.9  加样回收率实验取已知总黄酮含量的常春油麻藤细粉（含总黄酮12.29%）5份，每份约0.25 g，精密称定，加入芦丁对照品一定量，然后照“供试品溶液的制备”项下进行制备并测定，计算回收率，结果表明，5次测定的平均回收率为97.64%，RSD=1.92%(n=5)。说明该测定方法测得的结果准确。数据见表5。表5  加样回收率实验（略）
       2.2  用正交实验优选总黄酮的提取条件
       2.2.1  实验安排选择乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数4个因素，每个因素选择3个水平，编制L9（34）因素水平表［3，4］，见表6。将对应的各因素和水平填入表7，按表7安排的条件进行实验。表6  L9（34）因素水平（略）
       2.2.2  结果分析实验结果见表7。用SPSS 13.0进行方差分析，结果见表8。表7  L9（34）正交实验设计（略）表8  总黄酮含量分析（略）
       Corrected Model 统计量F＝8 109.128，P=0.000<0.05,所选模型有统计学意义，其中A，B，C，D均是P＝0.000<0.05，说明它们对实验结果均有显著性影响，其因素的主次顺序为：A→B→D→C。再由各因素的均数判断其最佳水平，其中A应选2水平，B选3水平，D选1水平，C选1水平，所以最佳实验方案是A2B3D1C1，即30倍量60%乙醇回流3次。40 min/次。
       在此工艺条件下，我们进行了验证实验，结果总黄酮的得率达到12.43%。结果见表9。表9  验证实验数据（略）
       3  讨论
       3.1  对照品的选择本实验选用芦丁作为对照品，因为芦丁是黄酮化合物中比较有代表性的一种，其B环的3，4，-邻二酚羟基部位发生紫外吸收，可以通过测定芦丁对照品的吸收度，从而求算供试品中总黄酮的含量。这是总黄酮含量测定实验中比较经典的方法。我们曾经尝试过用常春油麻藤中所含主要成分刺芒柄花素和大豆黄素作为总黄酮含量测定时的对照品，但是不论是否加显色剂，都不能使对照品和供试品在同一波长处有最大吸收。最终我们确定了以芦丁为对照品测定供试品中总黄酮的含量。
       3.2  显色剂和显色方法的选择
       3.2.1   显色剂的选择
       我们曾经尝试过不加显色剂，结果对照品在361 nm和257 nm处有最大吸收，而供试品在282nm处有最大吸收，因此我们考虑加入显色剂。我们尝试过AlCl3、Al(NO3)3、NaNO2- Al(NO3)3-NaOH显色体系，最终用NaNO2- Al(NO3)3-NaOH显色体系后，对照品和供试品在502  nm处都有最大吸收，故选择NaNO2- Al(NO3)3-NaOH显色体系作为显色剂。
       3.2.2  显色时间的确定
       有文献报道［3～5］，使用NaNO2- Al(NO3)3-NaOH显色体系时，步骤为加入0.3 ml 5% NaNO2溶液摇匀，放置6 min，加入0.3 ml 10% Al(NO3)3溶液摇匀,放置6 min，再加入4 ml 1 mol/L的NaOH溶液摇匀，放置15 min。但是，实验证实 NaNO2、Al(NO3)3、NaOH三者的体积比为0.3∶0.3∶8，且放置时间尽量控制在15 min以内显色效果更好，尤其是供试品，由于其中黄酮成分不只一种，化学性质相对于芦丁对照品不稳定，所以在加入显色剂后应尽快测定。
        
       3.3   关于供试品脱脂  
       我们用乙醚对常春油麻藤粉末进行脱脂预处理，然后提取，并与不进行预处理直接提取所得溶液的总黄酮含量相比较，结果发现，用乙醚脱脂的供试品溶液的总黄酮含量比未进行脱脂处理的供试品含量高。所以我们最后确定用乙醚对常春油麻藤粉末进行脱脂处理。见表10。表10  脱脂处理（略）
       3.4  回流提取和紫外测定过程
       为减小误差，应注意每一步的损失，索氏提取和抽滤时每一次使用的滤纸应转移至烧瓶中一起回流。同时，注意供试品提取液的稀释倍数，从而确保用紫外分光光度法测定时吸收度在0.2～0.7的适宜范围内。
       3.5  正交实验
       正交实验设计是一种多因素与多水平实验的设计方法，与单因素试验相比，减少了实验次数，并能准确地预测优化实验条件和结果，具有方便、适用、预测性好等特点，是优化提取工艺的一个非常有用的工具。本次实验结果显示，我们所选4个因素对总黄酮含量测定均有显著影响，其中乙醇浓度影响最大，其次是料液比，再次是提取次数，影响最小的是提取时间。最佳实验方案为A2B3D1C1。
       【参考文献】
         　　［1］林 茂，李守珍.三川潮，等.密花豆藤化学成分的研究［J］.中草药，1989，20（2）：5.
       
       ［2］魏永生，王永宁，石玉平,等.分光光度法测定总黄酮含量的试验条件研究［J］.青海大学学报（自然科学版），2003，21（3）：61.
       
       ［3］程 刚，黄赵刚，吴 键，等.正交试验法优选黄蜀葵花总黄酮提取工艺［J］.实用临床医药杂志，2006，10（4）：98.
       
       ［4］张道英，张 凌，许怀远.藏药打箭菊总黄酮的提取研究［J］.时珍国医国药, 2007,18（2）：440.
       
       ［5］郭亚健，范 莉，王晓强，等.关于NaNO2- Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨［J］.药物分析杂志，2002，22（2）：97.