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       【摘要】 
       目的分离鉴定藏药寨卡的有效部位并对其抗肿瘤活性进行初步研究。方法采用甲醇萃取、酸性氧化铝层析柱层析和谱图分析对寨卡有效部位进行分离提取和鉴定，采用S180荷瘤小鼠模型和CT-26荷瘤小鼠模型，探讨寨卡有效部位提取物的抗肿瘤活性。结果提取分离得到了寨卡中有抗肿瘤活性的有效部位，并经谱图分析鉴定该部位为硫代葡萄糖苷类。经抑瘤实验表明，其能明显抑制S180荷瘤小鼠和CT-26荷瘤小鼠的肿瘤增殖。结论硫代葡萄糖苷是寨卡抑制肿瘤增殖的有效部位，具有一定的抗肿瘤活性。
       【关键词】  寨卡；有效部位；硫代葡萄糖苷
       Preliminary Study on the Extraction of  Active Fraction from the Seeds of  Tibet Medicine Thlaspi arvense Linn.  and its Antitumor Activities and its
       LI Yan,JIANG Nan,LUO Xia2,QING Yuan，XU Xiaoyan,YANG Zhirong
       (1.School of Life Science,the Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment, Ministry of Education,Sichuan University，Chengdu 610064，China;2.Celluar and Molecular Lab of Sichuan Institute of Chinese Materia Medical, Chengdu 610064, China)
       Abstract:ObjectiveTo extract and identify the active fraction of the seeds of  Tibet Medicine Thlaspi arvense Linn. and to study its antitumor activities. MethodsThe active fraction of Thlaspi arvense linn was extracted and identified by nethanol-extraction,tart-Al2O3 colum chromatography,TLC and HPLC.The anti-tumor effect was observed on the mouse model of S180 AND CT-26.ResultsThe active fraction of Thcaspi aruense Linn. was glucosinolate,and it could evidently inhibit the tumor propagation of  the two kinds of animal models.ConclusionGlucosinolate is the active fraction of Thlaspi arvense Linn and it has good antitumor effects.
       Key words:Thlaspi arvense Linn;  Active fraction;   Glucosinolate
       
       寨卡是一味常用藏药，为十字花科植物菥蓂Thlaspi arvense Linn.的干燥成熟种子。在传统藏医药应用中，寨卡主要用于治疗目赤肿痛、流泪、肺热、咳嗽、肾热、淋病、消化不良、呕吐等病症。目前，国内外针对寨卡开展的系统研究甚少，仅通过初步的植物化学研究知其含黑芥子苷（Sinigrin）、脂肪油、挥发油、卵磷脂等成分，因此，开展寨卡有效部位分离提取和药效研究，对藏药寨卡的药物开发具有良好的指导作用和应用价值。
        十字花科植物已被大量研究证实具有非常突出的抗肿瘤活性，主要原因是其富含抗癌活性成分前体——硫代葡萄糖苷（Glucosinolate）类物质。硫代葡萄糖苷在一些十字花科植物中的含量大约占干重的1%，在一些植物种子中的含量达到10%［1，2］。当十字花科植物因收割、加工、咀嚼等或植物水解而使其细胞破碎时，内源性黑芥子酶释放出来，使硫代葡萄糖苷水解为异硫氰酸盐（isothiocyanates，ITCs）、硫氰酸盐（thiocyanates）和腈（nitriles）而发挥抗肿瘤作用［3，4］。
        本实验室在前期已经研究发现寨卡粗提物具有明显的抑制肿瘤增殖活性的作用，且发现等剂量的寨卡粗提物与芥子苷纯品相比，抑瘤活性更强；根据现有资料，本实验室推测寨卡抗肿瘤有效部位可能为硫代葡萄糖苷类物质。在此基础上，本文拟开展对寨卡有效部位进行提取、分离和鉴定的研究，并对有效部位抗肿瘤活性进行验证。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器 
       旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司，SENCO R201），层析柱（上海沪西分析仪器厂有限公司，φ25 mm×300 mm），蠕动泵（WATSON MARLOW 504U），HPLC：Waters 1525，Waters 2487，SPD-10AV紫外检测器，AICHROM色谱柱，色谱工作站（天津），凝胶成像系统（BIO-RAD，Gel Doc XR）。
       1.2 药材 
       寨卡采摘收集自四川省阿坝藏族羌族自治州红原县，经四川省中药研究所中药研究室鉴定为十字花科植物菥蓂Thlaspi arvense Linn.的成熟种籽。
       1.3  细胞系和实验动物 
       S180（小鼠腹水瘤细胞）,由四川省中药研究所提供；CT-26（小鼠结肠癌细胞，ATCC编号：CRL-2638），购于南京凯基生物科技发展有限公司。昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，18～22 g，由四川省中药研究所动物室提供（川实动质第2002-33号）；BALB/C纯种小鼠，雄性20～25 g，由四川省成都中医药大学动物中心提供。
       1.4 药品与试剂 
       芥子苷（Sinigrin），购于Sigma公司；酸性氧化铝，购于上海陆都化学试剂厂；甲醇、乙醇、Pb(Ac)2、Ba(Ac)2和KNO3等提取试剂及层析分析试剂均为国产分析纯；色谱试剂均为国产色谱纯。
       2  方法与结果
       2.1  寨卡有效部位的制备［3］
       2.1.1  寨卡有效部位的提取 
       将寨卡炒香，打粉，过40目筛，得到寨卡粉末。在充分搅拌下，将600 ml甲醇中加热至微沸，缓慢加入200 g寨卡粉末，加料完毕后继续于微沸状态下搅拌20～30 min。待整个体系冷却，将其置于冰浴中使悬浮物完全沉降，收集上清液。固体残渣用600 ml体积分数为70%的甲醇水溶液进行第2次提取，保持微沸状态下搅拌20～30 min，冷却后，将其置于冰浴中使悬浮物完全沉降，收集上清液。合并提取液，加入其体积1/50的Pb(Ac)2-Ba(Ac)2 溶液（0.5 mol/L）沉降提取液中蛋白质。抽滤，滤液于40℃旋蒸浓缩至体积不再减少，以除去大部分甲醇，得棕色硫苷提取液。
       2.1.2  寨卡有效部位的分离和层析纯化 
       将“2.1.1”得到的浓缩提取液转入经蒸馏水平衡的酸性氧化铝柱中进行纯化，先用蒸馏水淋洗以洗净提取液中的有色杂质，再用 1 000 ml 0.1 mol/L KNO3 溶液淋洗，收集KNO3 溶液淋洗的全部洗脱液进行旋转蒸发浓缩，至近干时加入约30 ml的无水乙醇，继续浓缩至干，得到白色固体。将固体样品溶入150 ml甲醇中，达到平衡后滤去不溶物以除去其中的KNO3。滤液继续旋转蒸发至近干，溶于少量无菌水中，于-50℃下冷冻干燥，得到近似白色的固体粉末，即为寨卡有效部位提取物（active fractions of pennycress，ZAF），精密称重，计算得率。
        ZAF得率（%）=ZAF重量/寨卡药材重量×100%
       2.2  寨卡有效部位的谱图分析
       2.2.1  薄层层析法鉴定寨卡有效部位纯度 
       采用硅胶G板为层析板，展开条件为正丁醇∶乙醇∶氨水的比例为5∶1∶2。按比例配制展开剂。将4批次寨卡有效部位提取物（ZAF）点样后进行薄层层析。层析完后在紫外光下显色，并用凝胶成像系统照像记录。
       2.2.2  HPLC法检测寨卡有效部位含量 
       采用HPLC法对寨卡有效部位提取物（ZAF）进行检测，采用峰面积归一化法检验含量。HPLC的试验条件为：色谱柱为AICHROM，(5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相组成为乙腈∶水=20∶80，柱温30℃，流速1.0 ml/min，检测波长为227 nm。数据采集由Waters化学工作站完成。
       2.3  寨卡有效部位提取物（ZAF）对S180荷瘤小鼠瘤重的影响
       无菌传代后7 d的S180小鼠肉瘤细胞悬液，生理盐水稀释调整浓度为2×107个/ml，接种于昆明种小鼠右前腋窝皮下，0.2 ml/只，24 h后随机分为3组，每组10只，分别为模型对照组、ZAF低剂量组（25 mg/Kg），ZAF高剂量组（50 mg/Kg），按实验设计剂量腹腔注射给药，模型对照组给予等剂量生理盐水，1次/d，连续10 d。末次给药后24 h，小鼠称重，处死小鼠剥取瘤块，精密称重。采用统计学软件进行数据处理。实验所得数据采用±s表示，实验组与对照组用t检验。
       2.4  寨卡有效部位提取物（ZAF）对CT-26荷瘤小鼠瘤重的影响
       2.4.1  CT-26荷瘤小鼠的造模［4，5］ 
       用PBC洗涤处于对数生长期的CT-26小鼠结肠癌细胞，用胰蛋白酶消化液消化，用无血清培养液吹打稀释，以1 500 r/min的速度离心5 min，收集细胞并以PBS配制成细胞悬液，生理盐水稀释调整细胞浓度为1×106 个/ml，接种于BALB/C纯种小鼠右前腋窝皮下，0.2 ml/只。接种14 d后，小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下摘取皮下瘤体，立即置于消毒培养皿内，用无菌生理盐水洗涤，将瘤体剪成约0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm大小的瘤块，将瘤块塞入灭菌后的套管针头部腔内。选用6～8周龄，取标准体重的BALB/C纯种小鼠，右前肢外侧皮肤用碘酒消毒，将塞有瘤块的套管针穿刺至皮下潜行一小段后，用针芯将针腔内的瘤块推至皮下。接种后3 d即可出现皮下肿瘤结节，成功率100%。
       2.4.2  对CT-26荷瘤小鼠瘤重的影响 
       取接种后已成瘤的BALB/C纯种小鼠30只，随机分为3组，每组10只，分别为模型对照组、ZAF低剂量组（25 mg/kg），ZAF高剂量组（50 mg/kg），接种5 d后按实验设计剂量腹腔注射给药，模型对照组给予等剂量生理盐水，1次/d，连续21 d。末次给药24 h后，小鼠称重，处死小鼠剥取瘤块，精密称重。采用统计学软件进行数据处理。实验所得数据采用±s表示。实验组与对照组用t检验。
       2.5  结果
       2.5.1 寨卡有效部位分离提取得率经4次重复提取实验，得到4批次寨卡有效部位提取物（ZAF）。在寨卡有效部位整个分离提取过程得率约为0.30%。结果见表1。表1  ZAF得率（略）
       2.5.2  谱图分析鉴定寨卡有效部位
        薄层层析法检测寨卡有效部位提取物（ZAF）纯度：将4批次的ZAF按实验方法进行点样，薄层层析，并在紫外光下观察实验结果（见图1）。从实验结果中可看出，4个不同批次的ZAF都有一个在紫外光下显色、位置大致相同且颜色一致的荧光斑点，并且该点较为明亮。说明分离得到的ZAF虽是混合物，但其化学成分比较单一，主要成分相同，且含量高，可视作一个有效部位。
        HPLC法检测寨卡有效部位提取物（ZAF）含量：以芥子苷为标准品，采用HPLC法对ZAF主要成分的含量进行检测（采峰面积归一化法检验纯度）。结果显示，ZAF中的主要有效成分含量为85.70%（以芥子苷为对照品），见图2。图3为芥子苷纯品对照HPLC色谱。
        以上谱图分析方法均为硫代葡萄糖苷分析方法。由实验结果看出，寨卡有效部位的主要化学成分单一，以芥子苷为纯品对照时，出峰时间基本一致，且含量高，由此证明寨卡有效部位主要化学成分确为硫代葡萄糖苷类物质，符合本文推测。
       2.5.3   寨卡有效部位提取物（ZAF）对S180荷瘤小鼠瘤重的影响从表2可看出，ZAF低、高剂量都能有效抑制S180肿瘤细胞的增殖，小鼠瘤重低于模型对照组。其中，低剂量组具有显著性差异（P<0.05），高剂量组具有极显著性差异（P<0.01），表现出一定的量-效关系；同时也可看出，同等剂量下，ZAF抑制S180肿瘤增长的效果较芥子苷纯品好。
       2.5.4  寨卡有效部位提取物（ZAF）对CT-26荷瘤小鼠瘤重的影响从表3可看出，ZAF低、高剂量都能有效抑制CT-26肿瘤细胞的增殖，小鼠瘤重低于模型对照组。其中，低剂量组具有显著性差异（P<0.05），高剂量组具有极显著性差异（P<0.01），表现出一定的量-效关系。表2  ZAF对S180荷瘤小鼠瘤重的影响（略）表3  ZAF对CT-26荷瘤小鼠瘤重的影响（略）
       3  讨论
        硫代葡萄糖苷是广泛存在于十字花科植物中的抗肿瘤活性成分，到目前为止已发现有近120种［6］。本文通过回流提取、甲醇萃取以及酸性氧化铝层析分离，从寨卡中分离得到的有强抗肿瘤活性作用的有效部位，经谱图分析鉴定为硫代葡萄糖苷（Glucosinolate）的混合物。整个提取过程中，寨卡有效部位提取物（ZAF）得率约为0.30%，而通过本文方法，其中硫代葡萄糖苷含量可以达到85%以上。
        硫代葡萄糖苷的生物活性作用是经过水解之后的产物所表现出来的，研究发现，其降解产物异硫氰酸酯类物质具有显著的抗肿瘤活性［3］。本文S180和CT-26肿瘤在体动物模型研究实验表明，寨卡有效部位提取物（ZAF）对小鼠S180和CT-26实体瘤的生长有明显的抑制作用，并随着给药浓度的增加，小鼠瘤重明显减小，表现出一定的量-效关系，说明硫代葡萄糖苷在小鼠胃肠道酶的作用下发生了降解，其降解产物是异硫氰酸酯类物质。另外，从实验数据中也可看出，ZAF比同剂量的芥子苷纯品具有更好的抗肿瘤活性，可能与提取物为多种硫代葡萄糖苷混合物，存在协同抗癌作用有关。本实验鉴定了其抗肿瘤有效部位，并通过两种荷瘤动物模型验证，为藏药寨卡有效部位的提取分离提供了途径，为寨卡的抗肿瘤药效研究提供了直接依据，将为开发研制抗肿瘤单味藏药打下坚实的工作基础。
       【参考文献】
         　　［1］季宇彬,武晓丹,邹 祥.硫代葡萄糖苷的研究［J］.哈尔滨商业大学学报（自然科学版）,2005，21（5）：551.
       
       ［2］BARTEL B,FINK G R.Difeontial regulation of an auxin-preducing nitrilase gene family in Aradidopsis thaliana［J］.Proc.Natl,1994,91:6649.
       
       ［3］王忠英,王向阳.硫代葡萄糖苷及其降解产物异硫代氰酸盐［J］.生命的化学,2005,25（4）:342.
       
       ［4］Bresnick E,Birt D F,et,a1.Reduction in mammary tumorigenesis in the rat by cabbage and cabbage Residue［J］.Carcinogenesis,1990,11:1159.
       
       ［5］Hendrik Seeliger, Markus Guba,et.al. Blockage of 2-Deoxy-D-Ribose-Induced Angiogenesis with Rapamycin Counteracts a Thymidine Phosphorylase-Based Escape Mechanism Available for Colon Cancer under 5-Fluorouracil Therapy［J］.Clinical Cancer Research,2004,10:1843.
       
       ［6］周锦兰,胡建华,裘爱泳.油菜籽中主要硫甙的分离提纯［J］.色谱,2005,23（4）:411.