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       【摘要】 
       目的研究银杏叶提取物中的银杏萜类内酯A，B，C及白果内酯的含量测定方法并对贵州银杏药材银杏萜类内酯的含量进行调查研究。方法本实验采用甲醇超声提取样品，HPLC梯度洗脱。结果银杏萜类内酯日内和日间精密度的RSD均小于1.5%，稳定性实验的RSD为0.65%（n=5），最低检测限为0.50 μg/ml，加样回收率为97.7%，97.2%，94.7%，94.6%,RSD（n=5）分别为2.8%,2.3%,2.5%,2.1%。银杏叶提取物样品中GA，GB，GC和BB的总含量均符合《中国药典》（2005版）标准。结论该方法缩减了样品的前处理步骤，节约了实验时间，适用于银杏叶提取物中的银杏萜类内酯A、B、C及白果内酯含量测定；同时也证明贵州作为一个药材大省，银杏的质量也相对较好。
       【关键词】  高效液相色谱-蒸发光散射检测； 银杏叶提取物； 萜类内酯
       Determination of Ginkgolides in Ginkgo Biloba Extract from Guizhou by High-performance Liquid Chromatography
       PENG Quancai,YANG Zhannan, HU Jiwei,  ZHONG Li, JIANG Cuihong
       1.Guizhou Provincial Key Laboratory of  Mountainous Environment,Guiyang 550001, China;
       2.College of Bilological Technology and Engineering,Guizhou Normal University,Guiyang 550001, China;
       3.Medical College, Nanchang University,Nanchang 330031, China
       Abstract：ObjectiveTo develop a method for measurement of ginkgolide A,B,C, Bilobalide in the Ginkgo biloba extract from Guizhou Province.MethodsThe Ginkgo biloba leaves was extracted with methanol and gradient elution.ResultsThe theoretical plate number of Ginkgolide was 6088 ,the resolution was 1.42 and the tailing factor was 1.01.The Intra-day and inter-day precision (RSD) were all less than 1.5%, while the recurrence (RSD) was 0.65% (n=5).The limit of detection was 0.5μg/ml,the average recovery rates were 97.7%,97.2%,94.7% and 94.6%.ConclusionOur developed method can shorten the time used for Ginkgo biloba leaves pretreatment,and is a simple and reliable method to determine the content of ginkgolied A,B,C and Bilobalide in the Ginkgo biloba extract.The results also prove that the quality of Ginkgo biloba in Guizhou Province is relatively good.
       Key words：High-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detection;  Ginkgo biloba extract;  Ginkgolide
        银杏Ginkgo biloba Linn是我国的特有树种，又称为白果树、公孙树，属银杏科银杏属植物，原产于我国，是当今地球上最古老的树种之一。它的生命力非常顽强，从中生代的白垩纪晚期至新生代第四纪，地球上的气候发生变化，一百五十余种银杏类植物几乎全部灭绝，唯独银杏战胜了恶劣的环境存活至今［1］。银杏是我国二级保护植物，其果营养丰富，品味甘美；其叶、根、皮含有多种药用成分，尤其是银杏叶中有效成分提取物“黄酮苷”和“萜内酯”具有极高的药用价值。银杏作为一种药物应用已经有 600 年的历史了，早在宋朝我国民间就使用银杏叶治疗哮喘和支气管炎，其药用最早载于《神农本草经》，传统用于益肺气， 定喘嗽，缩小便，止白浊，生食降痰消毒杀虫［2］。银杏叶一般作为银杏药用部位，其味苦涩、性平，有毒，归肺经，是传统的止咳平喘药，银杏叶提取物常用的质量控制指标是黄酮和银杏内酯［3，4］，银杏总内酯(Total Lactone of Ginkgo,TLG)为银杏叶提取物其所含萜内酯成分( Extract of Ginkgo biloba , EGb761)包括银杏内酯A ，B，C 和白果内酯， 简称为 GA ，GB，GC 和 BB ，是主要的活性成分［5］，具有抗血小板活化因子(PAF)［6］、保护中枢神经系统 ［7，8］、对缺血损伤的逆转保护等作用，对抗血小板凝聚，抗老年痴呆症有明显的功效。也有研究表明银杏总内酯具有促进学习记忆能力的作用，其作用可能与增强机体抗氧化能力有关［9］。还有多项临床观察证实 EGb 能有效防治冠心病［10］，现在已发现银杏制品可治疗 47 种疾病［11］。银杏内酯 A ，B，C 为二萜内酯，白果内酯为倍半萜内酯，它们都具有 3 个五元内酯环和一个罕见的特丁基等结构特征，迄今尚未发现存在于其他任何植物中。我们运用 ChemDraw 软件构建了GA ，GB，GC 和BB的共同骨架分子结构（图1），同时使用 Chem3D 软件模拟了其3D构象（图2），这样就有便于我们直观地了解其最低能量(energy minimum) 时的分子构象。
       
       《中国药典》2005 版第Ⅰ部 HPLC-ELSD 选用正丙醇-甲醇-四氢呋喃为流动相等梯度洗脱测定银杏叶提取物中的内酯，样品前处理要经过水浴溶解-加盐酸-醋酸乙酯萃取-醋酸溶液洗涤-醋酸乙酯洗涤-蒸干-定容等过程，方法复杂、回收率比较难把握、而且重现性较差等。
        本实验采用 HLPC-ELSD 梯度洗脱测定银杏叶提取物中的内酯，简化了前处理步骤，具有回收率和重现性高，精密度好等优点，同时也证实贵州产银杏叶提取物中的内酯含量，对贵州产银杏药材的发展进行初步考证研究。
       1  器材
       1.1 仪器
       岛津高效液相色谱仪：HPLC-20AT；20μl进样阀；Model 300 ELSD；HW-2000 色谱工作站；药材粉碎机；瑞士BUCHI旋转蒸发仪；Simplicity 185 personal 超纯水器(美国Milli2 pore公司)；色谱条件：迪马C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；美国ELMA T660/H超声波清洗器(功率360W，频率35 kHz)。
       1.2 试药
       对照品银杏萜类内酯 A、B、C 及白果内酯购于中国药品生物研究所，批号分别为110862 - 200305，110863 - 200204，110864 - 200203 ，110865 - 200303；银杏叶提取物分别来自于贵州多家知名药厂送样。高效液相色谱流动相组成为色谱纯甲醇及超纯净水。
       2 方法与结果
       2.1  对照品溶液和样品溶液制备
       2.1.1  对照品溶液的配制 分别精密称取对照品GA，GB，GC BB 各3，3，3，4 mg置于10 ml量瓶中加甲醇到刻度，摇匀即得混合对照品溶液Ⅰ，分别取 2.50，0.50，0.25，0.05 ml，分别置于10 ml 量瓶中加甲醇到刻度，摇匀，即得混合对照品溶液Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，将上述5组对照品置于冰箱中备用。
       2.1.2  样品溶液的配制精密称定银杏叶提取物粗粉约 0.1 g(过40目筛，40℃干燥至恒重)置于 25 ml 量瓶中，加甲醇定容至刻度，超声处理15 min，放冷，摇匀，0.20 μm 滤膜过滤，取续滤液，上机备用。
       2.2  色谱条件
       2.2.1  色谱条件流动相：A相为水，B相为甲醇，梯度洗脱。B相随时间变化：30%（0～12min），30%～45%（12～25min线性），45%～30%（25～40min），40min（stop）；流速1.0ml/min；柱温40℃，进样20μl。
       2.2.2  蒸发光散射检测器条件漂移管温度：80℃，载气(空气)压力40 psi，放大系数(gain)为9。
        根据对照品的保留时间定性、峰面积比计算GA，GB，GC，BB的含量。
       2.3  色谱柱的选择分别用 Symmetry C18色谱柱(3.9 mm×150 mm，5 μm)、shim-pack C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)、迪马C18色谱柱(4.6 mm×300 mm，5 μm)进行对照品和样品的测定，结果表明，上述3种柱子峰型都很好，但从分离效果和效率综合考虑，我们选择了 shim-pack C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm)。对照品与样品的分析图谱见图3。
       2.4  前处理方法及检测器的选择
       曾采用药典方法先水浴溶解、醋酸乙酯萃取、醋酸溶液洗涤、醋酸乙酯洗涤、蒸干、定容等过程进行处理和用甲醇直接超声处理进行比较，结果表明，甲醇直接超声提取,提取率偏高，而按《中国药典》提取液杂质少分离效果较好，但考虑到超声直接提取也可以将样品较好的分离且回收率高，操作简便，故选择甲醇作为提取溶剂超声提取。
       
       银杏萜类内酯A、B、C 及白果内酯测定常用的检测器有紫外检测器和示差折光检测器。紫外检测器适用于带紫外吸收特征基团的物质，如果没有紫外吸收，则需经衍生化技术转化成有紫外特征吸收的物质，但这种操作复杂，且准确度受衍生物的稳定性的影响大； 示差折光检测器是一种通用型检测器，要求恒温、恒流速，且无法采用梯度洗脱，其检测灵敏度也不够高，所以对银杏萜类内酯A、B、C 及白果内酯的分离效果自然就差了。蒸发光散射检测器(ELSD)作为一种新型通用型检测器，弥补了HPLC传统检测器的不足，特别是对无紫外或紫外末端吸收的大分子有机化合物的检测，具有极大的优越性。
       2.5  线性关系考察
       将不同浓度的对照品溶液依次进样,分别重复3次,以对照品溶液浓度的自然对数为横坐标(X),峰面积的自然对数为纵坐标(Y)绘制标准曲线，线性回归。结果见表1。表1  4种萜类内酯的线性方程、相关系数与线性范围（略）
       2.6  精密度实验与稳定性实验
       以Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ对照品溶液，在1d 之内连续进样5次，以及连续 5 d 分别进样，根据所得峰面积分别计算日内精密度和日间精密度。银杏内酯对照品溶液低、中、高 3 个浓度的日内精密度和日间精密度的RSD分别为1.1%，0.9%，0.7%和1.5%，0.7%，0.8% ，结果表明方法的精密度良好。
       
       取第 2 批次银杏叶提取物的备用液, 按色谱条件进行测定，分别在0，3，6，12，18，24，36和 48 h 测定总萜类内酯的含量，考察稳定性，RSD为0.65%。
       2.7 回收率实验精密称取样品2的粗粉 5 份，各约 0.1g，分别加入 3mg对照品，分别按“2.1.2”项下条件制成样品溶液，每份测定6次，20ml进样测定，计算加样回收率。银杏叶提取物中白果内酯、银杏内酯A、B、C加样回收的平均回收率结果见表2。表2  银杏叶提取物中各萜内酯的回收率（略）
       2.8  检测限考察将银杏萜类内酯对照品溶液进行稀释，以信噪比为3∶1时，确定其最低检测限，其最低平均检测限为 0.50μg/ml。
       2.9  样品测定结果贵州当地药厂不同批次的银杏叶提取物样品测定结果见表3。表3  银杏叶提取物中萜类内酯的含量（略）
        我们也对其进行了数据统计处理（见图4）。通过统计图我们可以清晰的发现这次实验中所调查的样品之间的差异性和规律性。
       3  讨论
        本实验所建立的 HPLC-ELSD 方法与目前常用的银杏内酯含量测定方法相比，操作简便，不需水浴酸化，减少样品的前处理所带来的误差，提高了分析的精确度。
        方法学考察结果显示该方法准确度高、专属性强、灵敏度及稳定性均较好，测定方法可靠，测定结果能客观反映银杏的质量。实验结果对银杏药材、银杏内酯原料及制剂的质量控制都有重要的意义，可为银杏药材质量标准的制订提供科学依据。
        从实验结果可以看出, 从银杏内酯A ，B， C 和白果内酯的单个成分含量上看存在一定的差异性，但银杏中总萜类内酯含量差别比较小，不同批次的银杏叶提取物中总萜类内酯含量平均为7.18%。按照《中国药典》( 2005 版)规定银杏叶提取物中总萜类内酯的含量不得低于6.0%的标准，10批次的贵州银杏叶提取物的质量均符合要求，结果表明如果对贵州银杏原料严格控制质量，从药材的采集、贮藏到原料的提取都制定严格统一的标准，贵州银杏的应用将有很大发展。
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