文章标题 全文   多个检索词，请用空格间隔。

       【摘要】 
       目的提取高质量的高良姜基因组DNA，用于药材分子鉴定、分子系统分类和分子进化等下游分子生物学研究。方法在CTAB改良法基础上，采用4个方案提取DNA。结果用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA 的OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，产率为0.54～1.049 μg/ mg干燥叶片。基因组DNA能被限制性内切酶EcoRⅠ和Mse Ⅰ完全酶切，经AFLP分析，得到了条带清晰的DNA指纹图谱。结论 用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA纯度高，符合分子生物学研究要求。
       【关键词】  高良姜； 基因组DNA； 提取
       Extraction of Genomic DNA from Alpinia officinarum Hance
       PANG Qihua，YAN Ping,ZHAO Xuan,ZHAO Shujin
       (1.College of Bioscience and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China; 2.Department of Medicament, General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou 510010, China)
       Abstract:ObjectiveTo develop a method to prepare high quality genomic DNA of A. officinarum Hance for downstream molecubiological research. MethodsFour protocols based on modified CTAB method was performed to extract genomic DNA from A. officinarum Hance. ResultsThe OD260/OD280 ratios of genomic DNA extracted with the fourth protocol of modified CTAB method ranged from 1.8 to 2.0, the yields of DNA sample were in the range of 0.54～1.049 μg/mg dried leaf tissue. DNA samples were completely digested with restriction enzymes ( EcoRⅠ and Mse Ⅰ) and were successfully used for AFLP. ConclusionThe DNA samples extracted with the fourth protocol of modified CTAB method are with high quality and suitable for molecubiological research.
       Key words:Alpinia officinarum Hance;   Genomic DNA;   Extraction
       
       高良姜Alpinia officinarum Hance是姜科山姜属植物，在中国主要分布于广东、海南、台湾、云南和广西(后两省为引种)。高良姜干燥的根茎是著名的十大南药之一，有一千多年药用历史，据《中国药典》记载，高良姜味辛、性热，归脾、胃经，具有温胃散寒、行气止痛和消食的功效［1］，研究表明高良姜还有广泛的药理作用［2］，在香料生产和水果保鲜上也有应用 ［3，4］。长期的采挖和生态环境破坏，导致高良姜野生资源骤减，目前主要通过无性繁殖的方式进行人工栽培。近年来，国际市场对高良姜需求增大，国产高良姜远销中东和欧美，价格呈上升趋势，利益的驱动导致了混淆品和伪品的出现，影响了治疗效果，扰乱了市场，对高良姜的出口造成了负面影响。通过DNA分子标记技术建立高良姜的DNA指纹图谱，以及进行高良姜的分子系统分类、分子进化和遗传多样性研究，可以为高良姜的药材的分子鉴定和质量控制，以及高良姜种质资源保护和开发提供科学依据，而提取高质量的高良姜基因组DNA是进行下一步研究的前提条件。
        植物含有丰富的次生代谢物，这些化合物的存在干扰了基因组DNA的提取，不同的植物含有的次生代谢物不一样，基因组DNA的提取方法有所不同，主要有CTAB法和SDS法两种基本方法，并在此基础上进行改良以适合不同的植物［5～7］。本研究根据常规的CTAB法［8］进行改良，比较了4个方案提取高良姜基因组DNA的效果，其中，方案4提取效果较好，DNA纯度和产率较高，可以用于下游的分子生物学研究。
       1   材料与方法
       1.1  试剂和溶液CTAB，PVP-40，Tris为Genview分装，β-巯基乙醇、RNAse A为sigma分装，EDTA、氯仿、异戊醇、异丙醇和无水乙醇为国产分析纯，EcoRⅠ和Mse Ⅰ为NEB产品，λHind Ⅲ marker和DL2000 marker为Takara产品。
        清洗缓冲液： 200 mmol/LTris-HCl (pH8.0)；50 mmol/L EDTA；250 mmol/L NaCl；2%PVP-40(W/V)
        提取缓冲液A： 2%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；1.4 mol/L NaCl；2% PVP-40(W/V)
        提取缓冲液B：2%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；4 mol/L NaCl；2% PVP-40(W/V)
        提取缓冲液C：3%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；1.4 mol/L NaCl；2% PVP-40(W/V)
        10%CTAB溶液：10%CTAB；0.7 mol/L NaCl
        TE缓冲液：10 mmol/L TrisHCl（pH 8.0）；1 mmol/L EDTA（pH 8.0）以上溶液都经高压灭菌，备用。
       1.2  仪器1－15K高速冷冻台式离心机(Sigma)，D/U 530 DNA/Protein Analyzer (Beckman)，Model 200/210 Power Supply (BioRad)，DYCP－31D型水平电泳槽(北京市六一仪器厂)，White/UV Transilluminator凝胶成像仪。
       1.3  材料试验材料采自广东的广州、深圳和徐闻、海南万宁、广西南宁、云南西双版纳等地，经过中国科学院华南植物研究所邢福武教授鉴定为植物高良姜（A. officinarum Hance）。
        采摘高良姜顶端嫩叶，剪为约2 cm长的小段，放入装有干燥硅胶的密封袋中进行快速干燥，硅胶与叶子的体积比大约为10∶1，硅胶吸水变色时要更换硅胶，干燥叶片保存在密封的塑料袋中置于-20℃保存。
       1.4   提取DNA的步骤
       1.4.1  称取50 mg左右的干燥叶片，剪碎后放入研钵中添加液氮研磨成粉末状，迅速转移到2 ml的离心管中。
       1.4.2  加入800 μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液和20 μl β-巯基乙醇混匀，置65℃水浴1 h（每隔10 min颠倒G1次使溶液混匀），待溶液冷却置室温。
       1.4.3  加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），充分颠倒混匀5 min，12 000 r/min离心10 min，用剪去尖端的1 ml吸头小心吸取DNA水相转入另一2 ml离心管中。
       1.4.4  加入0.1体积10%CTAB溶液和等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），颠倒混匀， 12 000 r/min离心10 min，吸取DNA水相转入另一2 ml离心管。
       1.4.5  重复步骤“1.4.3”，把DNA水相转入1.5 ml的Axygen离心管中。
       1.4.6  加入0.6体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃放置30 min，沉淀DNA， 6 000 r/min离心10  min，去除上清液。
       1.4.7  DNA沉淀先后用1 ml 70%乙醇和90%乙醇浸泡洗涤5 min，6 000 r/min离心10 min，去除上清液。
       1.4.8  DNA沉淀在超净工作台中自然风干，用50 μl TE溶解DNA，加入5μl  RNAse A（10 mg/ml）于37℃中水浴2 h以上，DNA样品保存于-20℃备用。
       1.5  提取DNA的方案
       1.5.1  方案1步骤“1.4.2”加入提取缓冲液A。
       1.5.2  方案2步骤“1.4.2”加入提取缓冲液B。
       1.5.3  方案3步骤“1.4.2”加入提取缓冲液C。
       1.5.4  方案4在步骤“1.4.1”之后向离心管中加入1 ml清洗缓冲液，混匀并放置5～10 min，8 000 r/min离心10 min，去除上清液，然后步骤“1.4.2”加入取缓冲液A。
       1.6   DNA浓度、纯度的测定
       1.6.1  紫外分光光度计检测把DNA溶液稀释20倍，用紫外分光光度计中测定其在230，260和280 nm的OD值，根据OD260/OD280、OD260/OD230判断DNA的纯度，计算DNA的浓度和产率。
        DNA的浓度（ng/μl）＝OD260×50 ng/μl×稀释倍数
        DNA产率＝DNA浓度（ng/μl）×DNA原液体积（μl）/干叶重量/mg
       1.6.2  琼脂糖凝胶电泳用超纯水把DNA稀释到50 ng/μl，吸取5 μl DNA 与1 μl上样缓冲液混匀，在0.8%的琼脂糖凝胶上80 v电泳30 min，在UVP成像仪上观察和拍照。
       1.6.3  限制性内切酶酶切取6 μl基因组DNA（50 ng/μl）用限制性内切酶EcoRⅠ和Mse Ⅰ酶切3 h，在1.6%脂糖凝胶上100 v电泳30 min，然后在UVP成像仪上观察和拍照。
       1.6.4  AFLP分析DNA经EcoRⅠ和Mse Ⅰ双酶切后，与EcoRⅠ接头和Mse Ⅰ接头连接，接着进行预扩增、选择性扩增、6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，获得AFLP图谱，扫描保存图谱。
       2  结果与讨论
        从植物组织中提取DNA必须除去蛋白质、RNA、多糖、多酚等杂质，尤其是多糖和多酚，它们的存在会严重抑制限制性内切酶和TaqDNA聚合酶的活性［9，10］，影响后续的研究。DNA的纯度可以从OD260/OD280比值和OD260/OD230比值来判断。DNA在260 nm处有吸收峰，而蛋白质在280 nm处有吸收峰，理论上OD260/OD280＝1.8时表示DNA纯净，OD260/OD280＜1.8时表示有蛋白质污染，OD260/OD280＞1.8时表示有RNA污染，在230 nm处有吸收表示有多酚和色素污染［11］。
        用4种方案提取的DNA经紫外分光光度计检测显示（表1），用方案1和方案4提取的DNA产率都比较高，在0.45～1.05 mg/g之间，方案1提取的DNA的OD260/OD280比值在1.857～1.998之间，说明蛋白质去除得比较干净，而OD260/OD230比值在1.349～1.843之间，表示有少量的多酚和色素的污染；方案4提取的DNA的OD260/OD280比值在1.835～1.909之间，OD260/OD230比值在1.766～2.285之间，表示蛋白质去除得比较干净，多酚和色素的污染极少；方案2和方案3提取的DNA的产率都很低，在0.02～0.08 mg/g 之间，OD260/OD280比值分别小于1.642和1.027，OD260/OD230比值的范围为0.339～0.953，说明DNA有较多的蛋白质污染，多酚和色素污染严重。表1  不同提取方案提取DNA的效果比较（略）
        从琼脂糖凝胶电泳结果来看，方案1提取的DNA主亮带清晰且没有明显拖尾现象，但是加样孔较亮（图1 A），说明DNA较完整，但是多糖没有去除干净。方案2和方案3提取的DNA，未见有DNA亮带（图1 B），说明DNA含量很低，与分光光度计检测结果一致。方案4提取的DNA主亮带清晰，没有拖尾，加样孔比较干净（图1 C），表面DNA完整且纯度高。
        用方案4提取的基因组DNA经EcoRⅠ和Mse Ⅰ酶切，在1.6%脂糖糖凝胶上条带呈均匀的弥散状条带（图2），说明DNA被完全酶切，做AFLP分析能够得到清晰的多态性条带（图3），以上结果进一步表明，用方案4提取的DNA纯度较高，符合分子生物学研究的要求。
        我们用方案4提取了采自广东、海南、广西、云南等地170多份高良姜的基因组DNA，都取得了较好的效果，OD260/OD280比值在1.8～2.0的范围内，OD260/OD230比值大部分大于1.7，小部分OD260/OD230比值在1.7以下，可能是由于野外采集时，用干燥硅胶处理样品时没有及时更换，导致叶片褐变，提取DNA的时候很难完全除去褐变的色素。所有提取的基因组DNA都可以被限制性内切酶完全酶切和进行PCR反应，因此认为基因组DNA的纯度都符合研究要求。
       3  结论
        提取高良姜基因组DNA时应该注意以下事项：①幼嫩的叶子DNA含量高而次生代谢物含量低，因此试验材料尽量采幼嫩的叶子。用干燥硅胶处理叶片时应及时更换变色的硅胶，否则叶片容易褐变，影响以后DNA的提取和纯化。②用液氮研磨叶片时要彻底，研磨完要迅速转移到离心管中并置碎冰上保持低温。研磨彻底是为了得到较高的DNA产率，迅速转移是防止样品长时间与空气接触导致多酚物质被氧化，保持低温是为了抑制内源DNA酶和多酚氧化酶的作用，防止DNA降解和多酚氧化。③在抽提过程中，颠倒混匀溶液的动作不宜太剧烈，以防DNA被剪切断裂。④用氯仿/异戊醇抽提后吸取DNA水相时，谨防把中间蛋白层吸起来，以免影响DNA纯度。⑤用异丙醇沉淀DNA后，离心转速不宜太大，防止DNA沉淀被压得太实，不利于70%和90%的乙醇洗涤清除无机盐离子等小分子杂质，必须风干DNA 沉淀，防止乙醇残留。
       
       实验显示用含高浓度CTAB和高浓度NaCl的提取缓冲液提取高良姜基因组DNA（方案2和方案3）的效果不理想，DNA的产率很低，且纯度不符合要求。用液氮研磨叶子后，在细胞核、叶绿体和线粒体的膜结构裂解和DNA释放出来之前，用清洗缓冲液〔200 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)；50 mmol/L EDTA；250 mmol/L NaCl；2%PVP-40(W/V)〕把样品清洗一遍，可以清除细胞质中的可溶性物质，包括大部分的多酚和多糖，然后再用2%CTAB 提取缓冲液〔2%CTAB(W/V)；100 mmol/L Tris-HCl；20 mmol/L EDTA；1.4 mol/L NaCl；2% PVP-40(W/V)〕提取（方案4），这样有利于DNA的提取和纯化，结果表明用这个方案提取的基因组DNA纯度较高，符合分子生物学研究的要求。
       【参考文献】
         　　［1］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：202 .
       
       ［2］陈湖海，王 鹏.高良姜的化学成分及药理活性研究进展［J］.药学实践杂志，2004，22（6）：327.
       
       ［3］高海生，李春华，蔡金星，等. 天然果蔬保鲜剂研究进展［J］.中国食品学报, 2003，3（1）：86.
       
       ［4］谢小梅，龙 凯，钟裔荣，等. 高良姜、草果防霉作用的实验研究［J］.药物研究, 2002，11（5）：45.
       
       ［5］朱 旗，任春梅，洪亚辉，等.茶树叶片DNA提取、纯化和检测［J］.湖南农学院学报，1994，20（2）：114.
       
       ［6］李登科，黄丛林，田建保，等. 高质量枣树基因组 DNA提取方法的研究［J］.分子植物育种，2005，3(4):579.
       
       ［7］安泽伟，黄华孙.一种提取橡胶树叶中总DNA 的方法［J］.植物生理学通讯，2005 41（4）：515.
       
       ［8］马学军，舒跃龙，颜子颖，等.精装分子生物学实验指南［J］.北京：科学出版社，2005：1026.
       
       ［9］邹喻苹，葛 颂，王晓东.系统与进化植物学中的分子标记［M］.北京：科学出版社，2001：28.
       
       ［10］Porebski S, Bailey LG, Baum BR. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components. Plant Mol Biol Rep，1997，15：8.
       
       ［11］Sharma AD, Gill PK, Singh P. DNA isolation from dry and fresh samples of polysaccharide-rich plants. Plant Mol Biol Rep，2002，20：415a.