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       【摘要】 
       目的探讨马棘70％醇提取物（IPM）的抗动脉粥样硬化作用及机制。方法用不同浓度的马棘、肝素孵育体外培养的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 12 h后，加入氧化低密度脂蛋白（OX-LDL ）作用，用免疫组化和逆转录聚合链反应（RT-PCR）分别检测IPM对低密度脂蛋白受体（LDL-R）蛋白和mRNA表达的影响。结果马棘能明显降低小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的LDL-R蛋白和mRNA 表达，且对OX-LDL引起的LDL-R表达降低有保护作用。结论马棘具有降低巨噬细胞LDL-R的表达和逆转OX-LDL的作用，这可能是其抗动脉粥样硬化的重要作用机制。
       【关键词】  马棘 巨噬细胞 低密度脂蛋白
       Effects of 70% Alcohol Extract from Indigofera pseudotinctoria Matsum on Expression of LDL Receptor in Macrophage of Mice
       HU Zehua，GAO Bangpeng,HUANG Debin
        
       （Medical School of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000,China；Enshi Central Hospital,Enshi,445000,China  ）
       Abstract：ObjectiveTo explore the antiatherogenic mechanism of alcohol extract from Indigofera pseudotinctoria Matsum (IPM). MethodsThe cell was incubated with different concentration of IPM or heparin for 12 h that was established by culturing mouse macmphage RAW264.7, then OX-LDL was added into culture plate. The experiment was terminated after OX-LDL took action for 24 h. The expressions of LDL-R protein and mRNA were determined by immunohistochemistry or RT-PCR, respectively. ResultsThe expression of LDL-R protein and mRNA in mouse macrophage RAW264.7 was reduced after being incubated with OX-LDL for 24 h .IPM reinforcemented the expressions of LDL-R protein and mRNA which were reduced by OX-LDL . ConclusionOX-LDL can inhibit the expression of LDL-R protein and mRNA in macrophage. IPM can reverse this effect of OX-LDL . This may be one of antiatherogenic mechanism.
       Key words： Indigofera pseudotinctoria Matsum (IPM)；  Macrophage ；  Low density lipoprotein
       
       马棘（Indigofera pseudotinctoria Matsum，IPM）为豆科木篮属植物，以根或全株入药。又名一味药、野绿豆、马料梢、山皂角、野篮枝子。性味苦、涩，平，具有清热解毒、消肿散结之功效。用于感冒咳嗽，扁桃体炎，颈淋巴结结核，小儿疳积，痔疮；外用治疔疮。该植物广泛分布于全国各省市，资源丰富［1～3］。我们曾研究发现马棘醇提取部位具有显著镇痛作用［4］。本研究探讨70%马棘醇提物（IPM）对小鼠巨噬细胞低密度脂蛋白受体表达的影响。
       1  材料与方法
       1.1  试剂与仪器
       Gibco公司DMEN培养基和小牛血清；抗LDL-R多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；LDL（中国协和医科大学基础生化所）；大连宝生物工程有限公司逆转录系统和PCR core system；引物（武汉博士德生物工程有限公司）；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（中国协和医科大学细胞中心）；其他试剂为国产分析纯。上海第三分析仪器厂722 型分光光度计；日本 Olympus 公司XDP-1倒置显微镜；SHELDON LAB 公司TC 2323 型CO2 培养箱；依地酸（EDTA，sigma公司），3,3二氨基联苯胺（DAB）。
       1.2　马棘醇提取物的制备［5］
       马棘枝叶采自湖北建始，经湖北民族学院鲁开功教授鉴定为豆科植物马棘（Indigofera Pseudotinctoria Matsum，IPM），经10倍量70%乙醇回流提取两次，过滤，浓缩蒸干，研末，收率为14.3%。
       1.3  小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的培养［6，7］
       细胞培养瓶中接种RAW 264.7，调至pH 7.2～7.4，含胎牛血清10％、链霉素l×105 U·L-1、青霉素1×108 U·L-1的DMEN培养液，通以5 % CO2恒温37℃培养48～72 h，细胞融合后，用0.1％胰蛋白酶和EDTA0.08 %的混合消化液消化传代。实验前将细胞接种于细胞培养板，在无血清、无酚红的培养液中通以5 % CO2，37℃，培养12 h备用。
       1.4  氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的制备［6,7］
       将LDL置于恒温37℃、pH 7.2的PBS溶液（CuSO4，10 μmol·L-1）透析24 h，在含0.1 % EDTA的PBS中透析24 h终止反应，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用。脂蛋白氧化修饰程度以硫代巴比妥酸反应物质值来表示。结果OX-LDL为 21.4 μmol·L-1，LDL为 2 .2 μmol·L-1，说明LDL被氧化。
       1.5  动物分组共分6组，即：对照组（control group,CG）；OX-LDL组（OX-LDL group,OLG）；肝素组（100 mg·L-1,heparin group,HPG）；IPM 100，200，400 mg·L-1保护组（IPM-100,200,400）。取细胞计数为1×108个细胞·L-1的备用传代培养细胞，按每孔500μl 接种于6孔板，每组5孔，12 h细胞融合后，更换无血清无酚红DMEN培养液，后4组（HPG和IPM-100,200,400）分别加入相应浓度的肝素和IPM预处理，培养12 h后，除CG外，其余各组分别加入50 mg·L-1OX- LDL培养 24h 获细胞。
       1.6  LDL-R表达的检测（免疫酶标记法，SABC）［6］
       取细胞爬片，内源性过氧化酶以3% H2O2灭活，用羊血清封闭，加兔抗鼠LDL-R一抗，4℃，次日加山羊抗兔lgG二抗；加SABC复合物，DAB-H2O2显色。脱水、透明、封片，镜下观察，阳性物呈棕黄色。以德国欧波同VIDAs图像分析系统分析实验结果，小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 中LDL-R相对含量以细胞平均吸光度A值表示。
       1.7  LDL-R mRNA表达的检测（逆转录聚合酶链反应，RT-PCR）［7］
       按Trizol试剂说明一步法提取各组细胞总RNA。取总RNA 4 μl按试剂说明逆转录合成cDNA，取2 μl加入25 μl反应体系扩增，PCR扩增条件为：94℃，5 min；94℃，45 s；52℃,45 s , 72℃，1 min, 30个循环，72℃10 min。扩增后的LDL-R上游引物：5 " TCC ATC TTC TTC CCT ATT GC 3 "，下游引物：5 " CAG CCC AGC TTT GCT CTA 3 "，合成360 bp片断。内参照β-肌动蛋白上游引物：5 " TAT CCT CTC CCT CAC CCC ATC3 "，下游引物：5 " TCA GTA ACA CTC CGC CTA CAA3 "，合成639 bp片断PCR产物。用1％琼脂糖凝胶电泳显影，结果用天方凝胶图象分析软件分析，各组LDL-R mRNA 表达差异定量用各组目的基因与内参照基因的吸光度（A）比值来表示。
       1.8  统计学分析各组数据采用±s表示，配对比较采用t检验。
       2  结果
       2.1  IPM对RAW264.7细胞LDL-R mRNA
       表达的影响各组细胞均有LDL-R mRNA 表达，OX-IDL与小鼠单核巨噬细胞RAW264.7作用24h后，能明显降低LDL-R的mRNA表达，与CG比较，有显著性差异（P<0.01）；IPM-100,200,400 mg·L-1均能提高LDL-R mRNA的表达，且呈现浓度依赖趋势，以IPM-400 mg·L-1作用最强，与IPM-100和200 mg·L-1对比有显著性差异（P<0.05或P<0.01）.结果见图1及表1。表1 IPM对RAW264.7细胞LDL-R mRNA表达的影响（略）
       
       2.2  IPM对RAW264.7细胞LDL-R蛋白表达的影响
       LDL-R免疫组化结果显示，各组细胞均有LDL-R表达，表达强弱有明显差别；OX-LDL与 RAW264.7细胞作用24 h后能显著降低 LDL-R蛋白表达，与CG比较有显著差异（P<0.01）；IPM对OX -LDL引起的LDL-R表达下调均有保护作用，以400 mg·L-1组作用最强，与IPM-100和200 mg·L-1对比有显著性差异（P<0.01）；肝素（100 mg·L-1）对OX-LDL引起的LDL-R表达下调无明显作用，与CG相比无显著差异（P>0.05）。结果见表2。表2  IPM对RAW264.7细胞LDL-R 蛋白表达的影响（略）
       3  讨论
          
       动脉粥样硬化（AS）是心脑血管疾病的主要病理基础，其主要成因与脂质代谢紊乱有关［8］。流行病学及实验研究发现，血浆低密度脂蛋白（LDL）浓度与AS的发生呈正相关［9］。最新研究发现，LDL受体（LDL-R）对调节体内的胆固醇平衡，降低血浆LDL浓度起关键性作用，因而LDL-R功能的缺陷和异常是引起脂质代谢紊乱主要原因［10］。LDL-R是一种细胞表面糖蛋自，能与血浆中两种致AS脂蛋白（LDL和VLDL）结合，介导内吞和胞内分解，所以LDL-R对调节血浆总胆固醇（TC ) 含量起着关键作用［11］。因此，通过调控LDL-R的活性控制高脂血症，可以预防AS的发生与发展［9］。LDL-R基因表达调控的分子机制是：转录水平LDL-R基因启动子的激活和抑制、胆固醇类分子的负反馈抑制以及转录后mRNA分子稳定性的提高与降低［10］。LDL-R 基因转录的调控主要由胞内胆固醇（负反馈抑制性机制）和非胆固醇分子介导，前者涉及胆固醇调节元件结合蛋白（SREBP1和SREBP2）的合成及与LDL - R基因启动子胆固醇调节元件（SRE1）的结合［11］。当胆固醇浓度降低时，SREBP便结合到SRE1上，激活LDL-R基因转录，这一机制对于保持细胞的胆固醇平衡有重要意义［10］。非胆固醇介导的调控机制则通过蛋白激酶MEK/ERK信号转导进行，并与LDL-R基因启动子中的重复序列3有关［9］。
       
       本研究发现OX-LDL可降低LDL-R表达，与有关报道一致［8］。其机制可能为细胞摄取 OX-LDL后，使胞内胆固醇浓度升高，通过由胆固醇介导的负反馈抑制性机制，抑制了 SREBP与SREI结合，进一步抑制LDL-R转录与翻译［10］。IPM可逆转OX-LDL对LDL-R的下调，而且呈现浓度依赖趋势。其作用机制可能是：抑制泡沫细胞的形成，降低胞内胆固醇含量有关［9］，即通过降低胞内胆固醇含量，减少胆固醇介导的对LDL-R表达的负反馈抑制性，而增加LDL-R的表达［10］；IPM也可能通过蛋白激酶MEK/ERK信号转导途径，干扰LDL-R的转录所致［11］。这可能是其抗AS的作用机制之一，其详细的作用机制尚有待于进一步探讨。
       【参考文献】
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