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       【摘要】 
       目的正交实验法优选乳洁安胶囊的提取工艺。方法以浸膏得率，橙皮苷含量作为指标，采用L9（34）正交表优选乳洁安胶囊制备过程中水提醇沉工艺。结果乳洁安胶囊最佳水提工艺为药材10倍量水提取两次，1 h/次；最佳醇沉工艺为浓缩药液相对密度1.20，含醇量为 70% 。结论该水提醇沉工艺科学、合理。
       【关键词】  乳洁安胶囊 正交实验 水提醇沉 橙皮苷
       乳洁安胶囊是三峡大学第一临床医学院根据中医辨证理论研制的一种纯中药复方制剂，由丹参、当归、陈皮、蒲公英等组成，具有疏肝理气，活血化淤和软坚散结之功效［1］，临床上用于治疗乳腺增生等乳腺疾病多年，疗效满意。但原方为汤剂，临床上使用不便，现拟将其改作硬胶囊剂。本实验采用正交实验法对该胶囊剂的水提醇沉工艺进行了研究［2～4］。
       1  仪器与材料
       1.1  仪器德国KNAVER高效液相色谱仪（K-2501紫外检测器，K-501溶剂输液泵，Eurochrom色谱工作站）；KQ-100B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BP211D电子天平（Satorius）；DHG-9030A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）。
       1.2  试药　
       橙皮苷对照品（中国药品生物制品检定所，110721-200512）；甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。
       2  方法与结果
       2.1  水提工艺条件的优选
       2.1.1  因素水平的确定对水提过程中的主要影响因素（加水量、煎煮次数和煎煮时间）进行考察，每个因素取3个水平，选用L9（34）正交设计表安排实验，通过测定出膏率和橙皮苷含量来确定最佳提取工艺。表1  水煎煮实验因素水平（略）
       2.1.2  实验方法与浸膏得率的测定
       
       实验方法：按处方中各药材的比例，分别称取丹参、当归、陈皮、蒲公英等药材共9份，按表2安排正交实验。将煎煮液过滤，浓缩或稀释定容于1 000 ml量瓶中，摇匀，取25 ml蒸干备用（用于含量测定），余下的975 ml浓缩成浸膏，置真空干燥箱（80℃）中减压干燥。
       
       浸膏得率的测定：将减压干燥所得干浸膏称重
       
       浸膏得率（%）=所得浸膏净重取样量×100%
       2.1.3  橙皮苷含量测定
       
       色谱条件：色谱柱为AT.Chrom　C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（45∶55）；流速1.0 ml/min；紫外检测波长288 nm；柱温25℃；进样量20 μl。理论塔板数按橙皮苷峰计算应不低于3 000［5～7］。
       
       对照品溶液的制备：取橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.404 0 mg/ml的标准对照溶液，备用。
       
       标准曲线的制备：分别精密量取橙皮苷标准对照溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度。按上述色谱条件，各进样20 μl，记录色谱峰面积。以色谱峰面积为纵坐标，橙皮苷浓度（mg/ml）为横坐标进行线性回归，得回归方程为：Y = 593.53 X－3.984 0（r = 0.999 3）。结果表明：橙皮苷在0.0404 0～0.202 0 mg/ml的浓度范围内呈线性关系。
       
       供试品溶液的制备：分别取水煎煮正交实验中制得的含量测定样品（从1 000 ml中取得25 ml药液）蒸干得浸膏，加甲醇20 ml，超声30 min，使充分溶解后，过滤到25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，备用。
       
       测定波长的选择：分别取橙皮苷对照品溶液和流动相，置紫外分光光度计中，于200～400 nm波长范围内扫描，结果橙皮苷在288 nm波长处有最大吸收，故选择288 nm为测定波长。
       
       含量测定：分别取上述样品20 μl进行测定，结果见表2。表2  水提正交实验结果及方差分析（略）
       2.1.4  水提正交实验结果及方差分析结果见表2。
       以出膏率为指标，极差R值显示各因素影响作用主次为C＞A＞B；在给定的水平条件下，各因素对出膏率的影响情况为C3＞C2＞C1，B3＞B2＞B1，A3＞A2＞A1。方差分析结果表明，加水量，煎煮时间和煎煮次数对出膏率均无显著性影响，综合节省时间和资源的原则，单从出膏率的角度考虑，其优选工艺条件为A2B1C2。
       
       以橙皮苷含量为指标，极差R值大小显示各因素影响作用主次为A＞B＞C；在给定的水平条件下，各因素对橙皮苷含量的影响情况为A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1。方差分析结果表明，加水量对橙皮苷含量有显著性影响，而煎煮时间和煎煮次数对橙皮苷含量均无显著性影响，综合节省时间和资源的原则，单从橙皮苷含量的角度考虑，其优选工艺条件为A3B2C2。
       
       综合分析：从橙皮苷含量结果分析表明，随着加水量的增加，提取效果越来越好，但从出膏率结果分析来看，加水量并没有显著性影响，收膏率增大幅度较小。为了缩短煎煮时间，节约能源，降低成本，选择A2B1C2为水煎煮优选工艺条件，因此拟定乳洁安胶囊水煎煮提取的最佳工艺条件为取药材加入10倍量水煎煮提取两次，1 h/次。
       2.2  醇沉工艺条件的优选
       2.2.1  因素水平的确定为了除去杂质并最大限度地保留有效成分，减小服用剂量，在浓缩的水提液中加入适量乙醇以除去其中的淀粉、树胶等多糖类和蛋白质等杂质，选用L9（34）正交表对醇沉过程中的主要影响因素（加醇浓度和浸膏密度）进行考察，每个因素取3个水平，通过测定出膏率和橙皮苷含量来确定最佳纯化工艺。
       表3  实验因素水平
       2.2.2  实验方法与浸膏得率的测定
       
       实验方法：按处方中各药材的比例，分别称取丹参、当归、陈皮、蒲公英等药材共9份，按表3安排正交实验。将煎煮液过滤，浓缩至相对密度为1.25（20℃），等分为3份；分别加水调节相对密度为1.15，1.20和1.25；再各自等分为3等份，编号为1～9，分别置于250 ml锥形瓶中。在1～9号药液中加入相应量的95%乙醇，使药液含醇量符合正交设计要求。加乙醇时边加边搅拌，用封口胶封住瓶口，静置24 h。将1～9号药液分别过滤，浓缩或稀释至100 ml量瓶中，量取25 ml于蒸发皿，水浴蒸干，用于测定橙皮苷含量。余下75 ml浓缩成浸膏，置真空干燥箱（80℃）中减压干燥。
       
       浸膏得率的测定：将减压干燥所得干浸膏称重，按下式计算浸膏得率。
       
       浸膏得率（%）=所得浸膏净重取样量×100%。
       2.2.3  橙皮苷的含量测定
       
       供试品溶液的制备：分别取醇沉正交实验中制得的含量测定样品（从1 000 ml中取得25 ml药液）蒸干得浸膏，加甲醇20 ml，超声30 min，使充分溶解后，过滤到25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，备用。
       
       含量测定：分别取上述样品20 μl按“2.1.3”项下色谱条件进行测定。结果见表4。
       2.4  醇沉正交实验结果及方差分析结果见表4。表4  醇沉正交实验设计表与直观分析（略）
       以出膏率为指标，极差R值显示各因素影响作用主次为A＞B；在给定的水平条件下，各因素对出膏率的影响情况为A1＞A2＞A3，B1＞B2＞B3。方差分析结果表明，B因素对出膏率无显著性影响，综合节省时间和资源的原则，单从出膏率的角度考虑，其优选工艺条件为A2B2。
       
       以橙皮苷含量为指标，各因素的影响作用大小为A＞B；在给定的水平条件下，各因素对橙皮苷含量的影响情况为A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1。方差分析结果表明，A、B两因素对橙皮苷含量均无显著的影响，综合节省时间和资源的原则，单从橙皮苷含量的角度考虑，其优选工艺条件为A2B2。
       
       综合分析：从出膏率和橙皮苷含量结果分析表明，两者优选工艺条件为A2B2，因此拟定乳洁安胶囊醇沉的最佳工艺条件为合并滤液浓缩至相对密度为1.20，加乙醇使含醇量达70%。
       2.3  水提醇沉最佳工艺的验证
       2.3.1  水煎煮最佳工艺验证按处方比例称取当归、丹参、陈皮、蒲公英等药材共3份，按水提正交实验所选择的最佳工艺条件进行3次重复实验。分别测定浸膏得率和橙皮苷含量。结果见表5。表5  水煎煮最佳工艺验证（略）
       2.3.2  醇沉最佳工艺验证将“2.3.1”项中所得3份煎煮液按醇沉正交实验所选择的最佳工艺条件进行3次重复实验。分别测定浸膏得率和橙皮苷含量。结果见表6。表6  醇沉最佳工艺验证（略）
       2.4  乳洁安胶囊的制备
       2.4.1  乳洁安胶囊的提取工艺按处方比例称取药材，加入10倍量水，浸泡30 min后开始加热。加热至微沸时开始计时，1 h后第一次煎煮完毕，过滤，滤液备用。第2次再加入10倍量水，煎煮1 h，过滤。合并两次滤液，水浴上浓缩至相对密度为1.20，置1 000 ml具塞磨口瓶中，然后加入适量95%乙醇，加入乙醇的体积按下式计算：
       
       V=m×1ρ×x1-x
       
       式中，V为加入95%乙醇的体积（ml）；m为药液质量（g）；ρ为95%乙醇的密度（g/ml）；x为药液含醇量，根据优选为70%。
       
       加乙醇时边加边搅拌，加完后用封口胶封住瓶口，静置24 h后用布氏漏斗进行抽滤，滤液减压浓缩并于水浴上挥干，放入80℃真空干燥箱干燥，所得干浸膏粉供制备胶囊。
       2.4.2  乳洁安胶囊的制剂工艺
       
       乳洁安胶囊的处方组成：浸膏粉　270g，淀粉　180g，硬脂酸镁适量，制成　1000粒。
       
       乳洁安胶囊成型工艺优选：在进行成型工艺优选时，浸膏粉碎过80目筛，将直接装胶囊与制粒后装胶囊进行对比。结果显示，直接装胶囊在检查时存在装量差异超限和极易吸湿潮解的问题，通过考察药粉的流速和休止角，发现药粉的流动性太差，休止角约62℃，装量难于控制。为改善流动性，将浸膏干燥，研成细粉并过80目筛，加入适量淀粉（药粉∶辅料 = 3∶2），混合均匀, 以70%乙醇作为润湿剂，制粒（20目），于60℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁混匀，制成胶囊，即得。
       
       胶囊型号的选择：根据上述实验所得数据及临床处方用量折算，通过试装胶囊，最终确定装1号胶囊。
       
       乳洁安胶囊的制备工艺：将所得干浸膏粉研细，过筛，加入适量淀粉（药粉∶辅料 = 3∶2），混合均匀, 以70%乙醇作为润湿剂，制粒（20目），60℃干燥，整粒，加入硬脂酸镁混匀，制成胶囊，即得。每粒胶囊重约0.45 g，每粒胶囊含浸膏粉约0.27 g。
       3  讨论
          
       为使药材充分溶胀，故煎煮药材前浸泡30 min；提取过程中，为防止提取液浓度过大有效成分难以溶出，需要随时补充水分。药材经由水煎煮后, 在提取了有效成分的同时也溶解了大量的杂质, 故对药材水煎液进行醇沉处理，处理后的药液除去了一部分如蛋白质、糊化淀粉、粘液质等易溶于水而不溶于乙醇的杂质，但该方含糖量大，浸膏吸湿性强，故采取二次干燥法，即中途将浸膏撬动，使其干燥完全。
       
       以中药浸膏为原料制备胶囊剂的关键是要改善粉粒的抗吸湿性与流动性，本处方由丹参，当归，陈皮，蒲公英等组成。由于该方提取的浸膏粉量较大,故加入的辅料量不能过大，实验中通过考察几种常用辅料，最终确定选用淀粉作为添加剂。由于浸膏吸湿后黏性很大，故用乙醇做润湿剂制粒，实验过程发现选用95%乙醇制得的颗粒较好，能明显改善药粉的抗湿性，增加其流动性。粉末太细(＞ 80目) ，则流动性差，生产中不易于分装，容易造成产品装量差异大，制成20目的颗粒后，以上情况明显改善。本工艺经中试、稳定性实验、质量检测，结果证明该工艺合理可行。
       
       根据实验结果以及实际生产，确定乳洁安胶囊制备最佳工艺为：药材加入10倍量水煎煮提取两次，1 h/次，合并滤液浓缩至相对密度为1.20，加乙醇使含醇量达70%，静置24 h，滤过，滤液浓缩至稠浸膏，置真空干燥箱中干燥，干浸膏粉碎后与辅料混匀，加入70%乙醇制粒，过20目筛，装入1号胶囊，即得乳洁安胶囊。这样既保存了有效成分，减少了药粉体积，又保持了原方的治疗效果。
       
       本实验曾试图采用HPLC法测定当归中阿魏酸的含量作为指标，但由于阿魏酸化学性质较活泼，易发生氧化反应，故不宜作为质量控制指标。实验过程中曾用甲醇－醋酸－水（35∶4∶61）为流动相［8］，未能达到基线分离且峰形不好；后经实验摸索，最终选用甲醇－水（45∶55），色谱峰峰形对称性好，分离度好，理论塔板数较高。
       
       本实验为乳洁安胶囊研究中的部分内容，有关橙皮苷含量测定方法学研究将另文报道。
       【参考文献】
         　　［1］郑虎占．中药现代研究与应用［M］．北京：学苑出版社，1997：87.
       
       ［2］向梅先，苏汉文．正交实验法优选牛黄清热胶囊的提取工艺［J］．中药材，2006，29（2）：189.
       
       ［3］魏琴，李平，李红卫，等．正交试验法优选保肝醒酒胶囊水煎工艺［J］．中国药师，2007，10（10）：967.
       
       ［4］王巍杰，贾晓冬，王鑫国．正交实验法优选胃舒胶囊制备工艺［J］．时珍国医国药，2005，16（7）：629.
       
       ［5］王静竹，陈定一．高效液相色谱法测定陈皮中橙皮苷的含量［J］．中国中药杂志，1994，19（7）：424.
       
       ［6］崔丽华，管玉民．HPLC法测定陈皮中橙皮苷的含量［J］.中国药事，2000，14（2）：105.
       
       ［7］冯琦，罗春华．HPLC法测定藿香祛暑软胶囊中橙皮苷的含量［J］.黑龙江医药，2006，19（4）：236.
       
       ［8］国家药典委员会．中国药典，Ⅰ部［S］．北京：化学工业出版社，2005：152.