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       【摘要】 
       目的用肾气丸各拆方组水煎液灌胃肾阳虚大鼠，测定灌胃后各组大鼠下丘脑中多巴胺（DA）、五羟色胺（5-HT）的含量，分析肾气丸“阴中求阳”治疗肾阳虚证的机理。方法以氢化可的松25 mg/(kg·d）注射大鼠，连续12 d，同时以各肾气丸拆方组水煎液灌胃，于灌胃第21天，麻醉大鼠，取出下丘脑，称重，以5%高氯酸匀浆，高速低温离心后分取上清液，用高效液相色谱法检测DA，5-HT的含量。结果与正常组比较，模型组大鼠下丘脑中DA、5-HT含量升高，经灌胃给药后，各拆方组大鼠下丘脑中DA，5-HT的含量均有不同程度的降低，以阴阳双补组含量最低，而补阳组降低不明显，其中阴阳双补1组含量低于补阳1组，阴阳双补2组含量低于补阳2组,具有统计学意义。结论降低下丘脑中多巴胺、五羟色胺的含量，可能是肾气丸“阴中求阳”配伍治疗肾阳虚证的机理之一。
       【关键词】  肾气丸 阴中求阳 肾阳虚证 多巴胺 五羟色胺 高效液相色谱法
       Influence of Compatibility of Shenqi Pill "Reinforcing Yang from Yin" on the Contents of DA,5-HT in Hypothalamus of Deficient Kidney-Yang Rats
       WU Yong，LI Zhengmu，ZHUO Lianjia，CHEN Weixuan，FAN Mingwei
       （Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China）
       Abstract：ObjectiveTo study the influence of compatibility of Shenqi Pill "Reinforcing Yang from Yin" on the contents of DA,5-HT in hypothalamus of deficient kidney-yang Rats.MethodsThe rats were injected with cortisone at the dose of 25 mg/(kg·d) for consecutive 12 days and adminstered with dismantled decoction at the same time. On the 21st day, the rats were sacrificed and the contents of DA ,5-HT  in hypothalamus were measured by the method of high performance liquid chromatogram. ResultsCompared with normal group, the contents of DA,5-HT was increased in model group. After intragastric administration, the content of DA,5-HT in each dismantled group were decreased at different level in hypothalamus. The first group of invigorating yin-yang was higher than the first group of invigorating yang, the second group of invigorating yin-yang was higher than the second group of invigorating yang, and all of these had statistic significance. ConclusionThe decrease of DA,5-HT contents in hypothalamus is likely to be the mechanism by which Shenqi Pill treats the kidney-yang asthenia syndrome by the compatibility of "reinforcing yang from yin".
       Key words：Shenqi Pill;   Reinforcing yang from yin;   Kidney-yang asthenia syndrome;   DA；  5-HT;   HPLC
       
       肾气丸是临床治疗肾阳虚证的名方，方由大量滋阴补肾的药物配伍少量的桂枝、附子而成，以“阴中求阳”微微生火以治疗肾阳虚证。为分析肾气丸此种“阴中求阳”配伍治疗肾阳虚证的药效机理，本研究以氢化可的松制作大鼠肾阳虚模型，观察肾气丸及其各拆方组水煎液灌胃大鼠后，比较各组大鼠下丘脑神经递质多巴胺（DA）、五羟色胺（5-HT）的含量变化。现报道如下。
       1  材料与仪器
       1.1  动物健康SPF级雄性SD大鼠88只，体质量200g左右，广东省实验动物中心提供［质量合格证编号:0026197,许可证号：SCXK（粤）2003-0002 粤监证字2007A003］。正常光照，自由饮水、摄食，适应性喂养5 d后，随机分为正常组（A组）、模型组（B组）、补阳1组（C组）、补阳2组（D组）、补阴1组（E组）、补阴2组（F组）、阴阳双补1组（G组）、阴阳双补2组（H组），共8组，每组11只。
       1.2  仪器日立CR22G低温高速离心机；DIONEX Summit高效液相色谱仪（美国DIONEX公司），Chromeleon色谱工作站（美国DIONEX公司），HP1049A电化学检测器（美国安捷伦公司），玻璃碳工作电极和Ag/AgCl参比电极，PHS-2C精密酸度计（上海理达仪器厂），分析天平 (万分之一，北京赛多利斯天平有限公司)。
       1.3  试剂氢化可的松（天津金耀氨基酸有限公司 批号：0612011），乌拉坦（国药集团化学试剂有限公司 批号120060323），多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）均购自sigma公司，乙腈购自美国TEDIA公司，其余试剂均为市售分析纯。
       1.4  药物分组肾气丸组方药材（经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定为正品），补阳1组（C组）：附子、桂枝；补阳2组（D组）：附子、桂枝＋茯苓、泽泻、丹皮；补阴1组（E组）：干地黄、山茱萸、山药；补阴2组（F组）：干地黄、山茱萸、山药＋茯苓、泽泻、丹皮；阴阳双补1组（G组）：附子、桂枝＋干地黄、山茱萸、山药；阴阳双补2组（H组）：即肾气丸组： 附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、丹皮；其中药物附子、桂枝、干地黄、山茱萸、山药、茯苓、泽泻、丹皮组成比例为1∶1∶8∶4∶4∶3∶3∶3（按原方比例）。
       2  方法和结果
       2.1  给药与取材除正常组大鼠外，其余大鼠均每天大腿内侧肌肉注射氢化可的松25 mg/kg，连续12 d，同时开始灌胃（药量按体表面积法［1］折算为成人用量的5倍，灌胃体积1 ml/100g）给药，正常组、模型组给予等体积生理盐水，连续给药20 d。于给药第21天上午8时，以乌拉坦（剂量1g/kg）麻醉大鼠，迅速取出大鼠全脑，分离出下丘脑，称重，以5%高氯酸匀浆，低温高速离心（-4℃ 15 000 r/min）30 min，分取上清液，存于-80℃冰箱待测。
       2.2  色谱条件色谱柱为Develosil C30-UG-5（150 mm×4.6 mm, 5 μm，日本Nomura Chemical Co., Ltd）；流动相为磷酸二氢钾溶液（25 mmol/L，内含乙二胺四乙酸二钠0.5 mmol/L，用磷酸调pH 3.4）∶ 乙腈 = 95∶5（体积比），用前经0.45 μm滤膜真空抽滤，流速0.5 ml/min；玻璃碳工作电极，Ag/AgCl参比电极，检测电位0.6 V；柱温25 ℃，自动进样器温度5 ℃。进样量50 μl。
       2.3  实验结果含量计算公式［2］：含量(μg／g湿组织)=CV／W，式中C为大鼠下丘脑样品测定浓度(μg／m1)，V为样品预处理过程中加入液体体积总量(m1)，W为下丘脑湿重(g)。实验数据采用±s表示，统计采用SPSS统计软件分析。结果见表1～2。表1  拆方肾气丸灌胃各组大鼠后下丘脑中DA的含量，表2  拆方肾气丸灌胃各组大鼠后下丘脑中5-HT的含量（略）
       3  讨论
          
       现代对肾阳虚证的研究发现［3］，肾阳虚患者普遍有尿17 羟皮质类固醇含量值低下的现象，肾阳虚证具有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴不同环节(层次) 、不同程度的功能紊乱，而通过对神经内分泌免疫网络的大量实验证实：肾阳虚证与神经内分泌免疫网络有内在联系，补肾药是调节下丘脑、神经内分泌免疫网络、下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺轴的有效手段, 肾阳虚证涵盖着神经内分泌免疫网络。另有研究证实［4］用外源性皮质酮造成大鼠下丘脑-垂体-肾上腺-胸腺（HPAT）轴模型以模拟“肾阳虚”证，从模型组看，由外源性皮质酮反馈抑制HPAT轴的同时，激活下丘脑等单胺类神经递质，如去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）、五羟色胺（5-HT）、五羟吲哚乙酸（5HIAA）等含量增高，同时温补肾阳药能明显改善上述指标，能明显改善HPAT轴的功能。
       
       多巴胺与五羟色胺均为抑制性神经递质，有研究显示［5］外源性糖皮质激素在抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）时，可能激活中枢单胺类递质（DA、5-HT）的合成与代谢，温补肾阳的右归饮在改善大鼠HPA轴抑制程度的同时，抑制其中单胺类递质的激活。本实验中大鼠在注射了外源性的糖皮质激素轻化可的松后，模型组大鼠下丘脑中多巴胺、5-羟色胺含量增高，经肾气丸各拆方组灌胃后，二者的含量均有不同程度降低，以阴阳双补组降低趋势显著。
       
       本实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠下丘脑中多巴胺（DA）、五羟色胺（5-HT）含量升高，经灌胃给药后，各拆方组大鼠下丘脑中DA、5-HT的含量均有不同程度的降低，以阴阳双补组含量最低，而补阳组降低不明显，其中阴阳双补1组含量低于补阳1组，阴阳双补2组含量低于补阳2组，具有统计学意义。即以“阴中求阳”的肾气丸全方组大鼠下丘脑中DA、5-HT的含量降低最为显著，并明显低于纯补阳组。
       
       中医认为阴阳互根互用，而“孤阴不生，独阳不长”，著名医家张景岳提出“善补阳者必于阴中求阳，则阳得阴助而生化无穷”。肾阳虚证若单用大量温补肾阳的药物反致虚不受补且有助热之弊，而通过在大量的滋阴补肾药中加入少量的温阳药，使温阳药化气有源，以阴中求阳来治疗肾阳虚证。肾气丸是临床上治疗肾阳虚证的名方，方以大量的滋阴补肾的药物配伍少量温阳的桂枝、附子而成，以达“阴中求阳”之意，微微生火以生肾气来治疗肾阳虚证。
       
       综上所述，温补肾阳药在降低多巴胺、无羟色胺含量的同时，改善下丘脑-垂体-肾上腺轴的功能，从而改善肾阳虚证症状。结合实验结果，模型组大鼠下丘脑中多巴胺（DA）、五羟色胺（5-HT）含量较正常组高，经灌胃给药后，各拆方组大鼠下丘脑中DA、5-HT的含量均有不同程度的降低，且以阴阳双补组的含量低于纯补阳组，说明大鼠下丘脑中DA、5-HT含量的降低与肾气丸“阴中求阳”的配伍相关，故降低下丘脑中多巴胺、五羟色胺的含量，可能是肾气丸“阴中求阳”配伍治疗肾阳虚证的机理之一。
       【参考文献】
         　　［1］陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993：1103.
       
       ［2］李伟荣，姚丽梅，宓穗卿，等.冰片对大鼠下丘脑组胺、5-羟色胺含量的影响［J］.中药材，2004，27（12）：937.
       
       ［3］沈自尹.从肾本质研究到证本质研究的思考与实践［J］.上海中医药杂志，2000，4：4.
       
       ［4］沈自尹.肾阳虚证的定位研究［J］.中国中西医结合杂志，1997，17（1）：50.
       
       ［5］蔡定芳，沈自尹，张玲娟，等.右归饮对皮质酮大鼠下丘脑单胺类递质含量以及体重饮食摄水的影响［J］.中国中西医结合杂志，1995，15（12）：728.