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       【摘要】 
       目的建立了高效液相荧光色谱测定大鼠海马中5-羟色胺（5-HT）含量的检测方法。方法采用Alltima C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液甲醇(9∶1,V/V)，等度洗脱，流速1.0 ml/min。激发波长（λEx）254 nm，发射波长（λEm）338 nm。结果线性范围为0.70～8.40 ng(r=0.999 9)；当信噪比为3（S/N =3）时，检出限为1.27×10-3 ng；日内测得精密度相对标准偏差(RSD)为0.7%；重复性测定相对标准偏差(RSD)为2.8%；加样回收率为88.6%～101.5%。结论该方法简便、准确、灵敏，特异性强，重复性好，适用于海马中5-HT的含量测定。
       【关键词】  5-羟色胺； 高效液相色谱； 荧光检测； 大鼠海马
       Study on the Determination of 5-hydroxy Tryptamine(5-HT) in Hippocampus of Rat by High Performance Liquid Chromatography
       ZHU Lingying, KONG Ming, PENG Yingru, WANG Peijuan 
       （Jiangsu Provincial Institute of Traditional Chinese Medicine ,Nanjing 210028，China）
       
       Abstract：ObjectiveThe content of 5-HT in hippocampus of rat was determined by high performance liquid chromatograph-fluorescence (HPLC-FLU). MethodsThe separation and determination were carried out by following conditions: Alltima C18 column (250 mm× 4.6 mm,5 μm), 0.1mol·L-1 KH2PO4 -methanol(9:1,V/V) as mobile phase , flow-rate was 1.0 ml·min-1.  The fluorescence excitation and emission wavelengths were set at λ_(Ex) 254 and λ_(Em) 338 nm, respectively.  ResultsThe linear range of the method was 0.70 ～8.40 ng(r=0.999 9) for 5-HT .The detection limit of 5-HT was 1.27×10-3ng, when the ratio of signal to noise was 3. The inter -assay precision was 0.7%. The recovery was within the range of 88.6%～101.5%.Conclusion The method is simple, sensitive, reliable and has strong specificity and good repetition .It is suitable for the content determination of 5-HT in hippocampus of rat, by high performance liquid chromatography.
       Key words：  5-hydroxy tryptamine (5-HT)；  High performance liquid chromatography；   Fluorescence detection；  Hippocampus of rat
       
       5-羟色胺（5-HT）是人体内一种重要的生物活性物质，参与脑缺血、镇痛、学习、记忆等多种生理过程，该物质广泛存在于脊椎动物脑内，在外周神经和其它组织中含量很低，对机体正常生理功能起着重要的调节作用［1～3］。因此定量测定5-HT含量对神经精神疾病、遗传性疾病、脑血管病以及发病机制的研究具有重要的价值。文献报道测定5-HT含量方法有比色法、荧光法、免疫法、高效液相-电化学色谱法（HPLC-ECD）、高效液相-荧光色谱法（HPLC-FLD）［4］。本实验采用HPLC-FLD对大鼠脑匀浆样品液直接进行5-HT含量的测定，通过对色谱条件的优化，建立了稳定、快速、灵敏的含量测定方法并用于大鼠海马中该类物质的测定，为疾病的发病机理研究提供依据。
       1  仪器和试剂
          
       美国Waters高效液相色谱仪（ 510泵， 474荧光检测器， 717自动进样器及柱温控箱等）；Empower色谱数据工作站；瑞士Mettler万分之一、十万分之一及百万分之一电子天平；美国Milli-Q纯水器；三洋MDF-382E超低温冰箱，Beckman 21R高速冷冻离心机，上海金达生化仪器厂XUF-1高速分散器。
       
       5-羟色胺（5-HT）标准品（1357359 33907213 美国Fluka公司）；甲醇为江苏汉邦科技有限公司的色谱纯甲醇；其它试剂均为分析纯。
       2  方法
       2.1  色谱条件色谱柱为Alltima C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相为0.1 mol/l磷酸二氢钾溶液-甲醇（9∶1 V/V）；单泵等度洗脱；流速1.0 ml/min，；λEx:254 nm；λEm:338 nm；柱温：35℃。
       2.2  标准品溶液的配制精密称取5-HT标准品适量，用0.1 mol/L盐酸制成0.35 mg/ml的对照品贮备液,避光冷藏保存。按实际检测需要，用0.1 mol/L盐酸溶液稀释到相应的溶度，供检测用。
       2.3  大鼠海马脑组织匀浆样品的制备取大鼠海马组织，称湿重，以1∶10的比例加入0.4 mol/L的高氯酸，(即每100 mg脑组织加1 ml 0.4   mol/L的高氯酸)。冰浴下充分匀浆，冰浴沉淀30 min，于4℃，10 000 r·min-1离心15min，取上清液，每毫升上清液加0.75 ml 4%的碳酸氢钠溶液、混匀后，于4℃、3 000 r·min-1离心5 min，取上清液，过0.45 μm滤膜，分装，于-80℃保存待用。
       3  结果
       3.1  标准液和样品液的色谱分离图在选定的色谱条件下，标准品液与按“2.3”项下方法处理的样品分别进样的色谱图见图1～2，从图中可知，5-HT 峰形良好，无杂质峰干扰，其保留时间为9.9 min。
       3.2  线性范围、检出限采用外标法，取0.7 μg·ml-1的5-HT标准液在选定的色谱条件下分别进样1，3，6，9，12 μl，以峰面积Y为纵坐标、进样量X（ng）为横坐标作图，检测线性范围为0.70～8.40 ng（r=0.999 9）；峰面积与进样量呈良好的线性关系；以信噪比为 3（S/N =3）时，计算检出限为1.27×10-3 ng。
       3.3  精密度、重复性实验在上述色谱条件下，取浓度为0.7 μg·ml-15-HT的标准液，重复测定5次，测得日内精密度相对标准偏差(RSD)为0.7%，表明实验方法精密度良好。
       
       取同一样品平行5份，按“2.3”项下方法处理，在上述色谱条件下，连续进样5次，考察样品峰面积的重复性，结果相对标准偏差(RSD)为2.8%。表明实验方法具有很好的重复性。
       3.4  回收率实验分别取浓度为0.175 μg·ml-1的5-HT标准品液6，8，10 μl；加入大鼠海马样品中，按“2.3”项下方法处理，重复测定6次。结果见表1。表1  5-HT的回收率测定结果（略）
       3.5  样品测定结果用本法测定20份大鼠海马组织中5-HT含量为(0.41×10-3±0.18 )μmol/g，样品均能基线的分离，结果令人满意。
       4  讨论
       4.1  测定方法选择本文对5-HT含量检测比较了高效液相-电化学(HPLC-ECD)和HPLC-FLD，发现应用HPLC-ECD方法时,检测器对流动相的改变较敏感，使系统不易稳定。最终选择了高效液相分析中高分辨率，高灵敏度的荧光检测法。建立了适用于检测5-HT物质简单、快速、重复性好的HPLC-FLD。在探索该测定方法时，作者观察到海马组织样品的处理要快，制备好的待测样品要保存在-80℃冰箱内，这对得到良好的分析结果至关重要。
       4.2  流动相条件优化流动相条件选择，比较了不同溶剂、pH值、浓度、比例、温度，经多次试验发现流动相中磷酸二氢钾的浓度在0.1 mol/L时与甲醇9∶1（V/V）配比后,在35℃流动相pH为4.6时,在此条件下的流动相等度洗脱，能使5-HT成分与杂峰基线分离且杂峰没有干扰，重复性好，由此确定为本实验分离条件。
       【参考文献】
         　［1］林凌云，李 慧，许崇涛. HPLC-荧光检测法测定大鼠脑组织中的单胺类神经递制质及相关物质［J］.华西药学杂志，2007，22（5）：557.
       
       ［2］张雷， 卢英俊， 邓同乐， 等. 高效液相色谱-荧光检测流速梯度法测定去卵巢小鼠脑内单胺类神经递质［J］.色谱，2005，1：76.
       
       ［3］石建， 缪丽燕. 高效液相荧光色谱法同时测定人体内5-羟色氨、5-羟吲哚乙酸［J］.苏州大学学报，2005,25(1):84.
       
       ［4］鲁燕侠，崔 佳，蔺兴谣，等.RP-HPLC-荧光检测法测定小鼠脑组织中5 种神经递质的含量［J］.解放军药学学报，2003，19（4）：262.