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       【摘要】 
       目的观察益肾蠲湿合剂对肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)增殖及细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)磷酸化的抑制作用。方法将含低、中、高剂量益肾蠲湿合剂的药物血清作用于10%血清-DMEM培养液培养的GMC, 分别用MTT 和Western Blot 方法检测细胞增殖和磷酸化ERK1/2的表达。结果益肾蠲湿合剂对GMC增殖有明显的抑制作用，并随着剂量的增加作用也逐渐增强。细胞总ERK在各组间无明显差别。但不同浓度的益肾蠲湿合剂均显著地抑制血清所诱导的ERK1/2的磷酸化。结论益肾蠲湿合剂可通过抑制ERK1/2的磷酸化抑制GMC的增殖。
       【关键词】  益肾蠲湿合剂；肾小球系膜细胞； 增殖； 细胞外信号调节激酶
       Effect of “Yishenjuanshi” Mixture on Proliferation of Glomerular Mesangial Cell and the Phosphorylation of Extracellular Signal-Regulated Kinases
       SUN Ying, ZHANG Xuepeng, ZHANG Jian, YANG Fang*
       (Pathological Department, North China Coal Medical College, Tangshan,Hebei 063000, China; Affliated Hospital, North China Coal Medical College, Tangshan,Hebei 063000, China; Integrated Traditional Chinese and Western  Medicine Hospital, North China Coal Medical College, Tangshan,Hebei 063000, China)
       Abstract：ObjectiveTo observe the effect of “Yishenjuanshi” on the proliferation of glomerular mesangial cells (GMCs) and the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinases (ERK). MethodsAll herbs in “Yishenjuanshi” mixture were boiled in water and concentrated to different doses. After 7 days of “Yishenjuanshi” treatment, serum from rats eye blood was collected. GMCs were cultured in serum free medium for 48hs and then 10% FSC-DMEM with or without serum including “Yishenjuanshi” to detect GMCs proliferation and expression of phosphorylated ERK (p-ERK) by MTT and Western Blot respectively.ResultsLow, medium and high dose of Yishenjuanshi” treatment significantly inhibited GMC proliferation when GMCs were cultured for 24, 48 and 72 h; and the inhibition ratios increased as the dose increased. There was no difference in total ERK expression. However, “Yishenjuanshi” treatments with different dose all markedly inhibited p-ERK expression stimulated by FCS.Conclusion “Yishenjuanshi” treatment inhibits GMC proliferation via blocking ERK phosphorylation.
       Key words：“Yishenjuanshi” mixture;  Glomerular mesangial cell;  Proliferation;  ERK
       
       复方益肾蠲湿合剂是华北煤炭医学院张健教授在多年临床和实验研究的基础上，拟定的治疗各型慢性肾炎的基本方药。本方直接针对慢性肾炎基本发病机理，重用黄芪，辅以枸杞、猪苓等药物，起到补气，滋肾阴、清热、解毒等作用。既往研究表明益肾蠲湿合剂在治疗临床狼疮性肾炎及实验性家兔系膜增生性肾炎取得了良好的效果［1，2］，不但明显缓解了慢性肾炎的临床症状，还全面改善了肾功能，从而延缓肾小球硬化和慢性肾炎的进展。导致慢性肾炎和肾小球硬化的重要原因之一是肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)的过度增殖［3］，为此本研究将观察益肾蠲湿合剂对GMC增殖的抑制作用，并进一步探讨其作用机理，从细胞和分子生物学方面探讨其防治肾小球硬化的作用机制。
       1  材料与仪器
       　1.1  益肾蠲湿合剂水煎液由华北煤炭医学院中西医结合医院提供。
       1.2  细胞大鼠肾小球系膜细胞(HBZY1)由武汉大学中国典型培养物保藏中心提供。
       1.3  仪器及试剂超净工作台(美国 Forma scientific company)；倒置显微镜(日本Nikon公司)；CO2 恒温培养箱(美国 Forma scientific company)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma公司产品)；抗体（p-ERK1/2和t-ERK1/2）（美国 Cell Signaling）。
       2  方法
       2.1  含药血清的制备［4］将大鼠随机分为4组，即对照组，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂组。对照组给予等体积的生理盐水，益肾蠲湿合剂以临床成人日用量的10倍作为中剂量，20倍和5倍分别作为高剂量和低剂量。灌胃给药连续7 d，第7天重复给药两次，间隔时间2 h，并于末次给药后1 h后，眼球取血，无菌条件下分离血清，置56℃水浴30 min灭活抗体，再经0.2 μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。
       2.2  细胞增殖的测定检测采用四唑盐(MTT)比色法。GMC传代后，制成密度为1.5×104/ml的细胞悬液，加入96孔板内．每孔200 μl，置37℃，5% CO2培养箱中孵育24 h，吸弃上清液，加入无血清培养液200 μl。继续培养48 h，使绝大部分细胞处于同步（G0期）。弃上清液，分别加入DMEM 培养液（160 μl）、血清（20 μl）及低、中、高剂量的含药血清（20 μl），每组设5个复孔，分别于培养24，48和72 h时取出培养板加入MTT 20 ul(5 mg/m1)，继续培养4 h，吸弃各孔培养液，加入100 μl DMSO，室温避光，轻轻振荡10 min，使结晶充分溶解后，酶标仪490 nm波长处读取OD值。
       2.3  磷酸化ERK1/2（p-ERK1／2）表达的检测GMC经上诉方法同步化后，分别加入DMEM 培养液（160μl）、血清（20 μl）及低、中、高剂量的含药血清（20 μl），每组设2个复孔，培养2 h。用预冷的PBS洗涤3次，加入细胞裂解液(50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaC1，1% NP-40，0.1％ SDS，0.5% DOC，2 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，10 μmol/L leupeptin，1 μmol/L pepstatin A，1 mg/ml Laprotinin)裂解细胞，冰浴30 min后, 4℃ 10 000 r/min 离心10 min，收集上清。考马斯亮蓝染色检测总蛋白浓度后，取135 μg总蛋白按常规方法进行8％ SDS-PAGE电泳并转膜，根据Marker定位保留含目的条带区域的硝酸纤维素膜并用质量分数5 %脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入封闭液稀释的抗p-ERK1/2或t-ERK1/2的Ⅰ抗，4 ℃过夜。次日漂洗3次后，加入稀释后的Ⅱ抗，室温反1 h。漂洗3次，加入DAB 显色。p-ERK1/2和t-ERK1/2蛋白大小约为42，44 KDa。图片分析仪扫描后，Quantity one 软件分析。
       2.4  统计学处理用SAS软件进行统计处理。所有数值以均数±标准差表示，两样本间均数的比较采用t检验。 P<0.05为差异显著，用a表示；P<0.01为差异极显著，用b表示。
       3  结果
       3.1  益肾蠲湿合剂对GMC增殖的影响由表1看出，低、中、高剂量的益肾蠲湿合剂不同程度地抑制了血清诱导的GMC的增殖，其中以高剂量的益肾蠲湿合剂的抑制作用最为明显，抑制率在24,48和72 h分别为31.7%，39.3%和47.5%；中剂量组也显著地抑制了GMC的增殖，抑制率分别为25.9%，32.2%和40.5%；低剂量组也有效地抑制GMC的增殖，抑制率分别为13.3%，19.3%和28.3%。与对照组相比，各组在各时间点的抑制率均有统计学意义。另外，益肾蠲湿合剂的抑制作用随着作用时间的延长或剂量的增大而明显增强，存在一定的时效及量效关系。
       3.2  益肾蠲湿合剂对GMC ERK1/2磷酸化的影响各组Total-ERK1 (t-ERK1) 和 Total-ERK2 (t-ERK2)的表达没有明显区别。血清所诱导GMC ERK1/2的磷酸化（p-ERK1/2）可明显被“益肾蠲湿合剂”所抑制，并且随着剂量的增加抑制作用也增强。在对p-ERK1的抑制中，低、中和高剂量组的抑制率分别为52.3%，69.8%和74.6%；对p-ERK2的抑制率分别为48.0%，68.8%和72.8%, 具有一定的量效关系。与正常对照组相比，各组均有统计学意义。结果见图 1及表2。表1  不同剂量的益肾蠲湿合剂对血清诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响（略）表2  不同剂量的益肾蠲湿合剂对血清诱导的p-ERK1/2表达的影响（略）
       4  讨论
          
       肾小球系膜细胞(GMC)存在于肾小球毛细血管之间，具有合成分泌系膜基质，吞噬沉积的免疫复合物的作用。正常时GMC不发生明显的增殖，但在慢性炎症等病理情况下则出现异常的增生，过度增殖的GMC及其分泌的基质一方面突入肾小球毛细血管壁，导致管壁增厚、管腔狭窄，另一方面积聚在肾小球内,导致肾小球硬化，造成肾脏功能进行性损害［3，4］。因此，有效地抑制GMC的增殖将会在很大程度上减缓肾小球硬化及慢性肾炎的进展。自拟中药复方益肾蠲湿合剂以黄芪为君，辅以枸杞、猪苓等药物，起到补气、滋肾阴、清热、解毒等作用。既往研究表明其在临床治疗狼疮性肾炎及实验性家兔系膜增生性肾炎中均取得了良好的效果［1，2］，临床上，不但明显缓解了临床症状还全面改善了肾功能。本研究利用体外培养的GMC，观察含不同浓度益肾蠲湿合剂的药物血清对GMC增殖的抑制作用，结果证实该中药复方有效地抑制了GMC的增殖，并且最高抑制率达47.5%。孙晋芳等［5］人曾报道黄芪的重要成分黄芪皂苷可将GMC阻滞在G0/G1期，从而抑制细胞的增殖。本复方重用黄芪，推测可能与这一作用有关。
       
       细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinases,)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，被磷酸化后激活，是传递丝裂原信号的重要传导蛋白，负责将信号从表面受体传导至细胞核内，促进细胞增殖。已知ERK包括五个亚族(ERKl-ERK5)，其中以ERKl和ERK2分布最为广泛， 研究最多。Bassa 等［6］报道脂多糖通过诱导ERK1/2的磷酸化（p-ERK1和p-ERK2）促进人GMC的增殖。Welsh等［7］也报道激活的ERK通过增加细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）推动细胞进入细胞分裂周期。为进一步探讨本复方抑制GMC增殖的机理，我们观察了磷酸化的ERK1/2 的表达情况。结果显示T-ERK1/2的表达在各组之间没有明显区别，但各剂量组均能明显地抑制血清诱导的ERK1/2的磷酸化，其中对ERK1的最高抑制率达74.6%，对ERK2的最高抑制率达72.8%。说明益肾蠲湿合剂可以通过抑制ERK1/2的磷酸化来抑制GMC的增殖，从而延缓肾小球的硬化和慢性肾炎的进展。但其是否还可以抑制GMC分泌系膜基质还有待于进一步研究。
       【参考文献】
         　［1］孙 影，刘 阳，杨 方，等. 益肾蠲湿合剂治疗狼疮性肾炎疗效观察［J］. 辽宁中医杂志, 2008, 9:1368.
       
       ［2］张 健，张数峰，杨金生，等. 益肾蠲湿合剂治疗实验性家兔系膜增生性肾炎的研究［J］. 华北煤炭医学院学报, 2006, 8(3):292.
       
       ［3］Diez-Marques L，Ortega-Velazquez R，Langa C, et a1．Expression of endoglin in human mesangial cells: modulation of extracelular matrix synthesis［J］．Biochim Biophys Acta, 2OO2, 1587(1):36.
       
       ［4］钟 丹，杨霓芝，赵代鑫，等. 中药复方通脉口服液对肾小球系膜细胞增殖及分泌IL-1 β的影响［J］. 时珍国医国药, 2008, 19(1):4.
       
       ［5］孙晋芳，焦金菊，宋其蔓，等. 黄芪皂甙对大鼠肾小球系膜细胞增殖及周期的影响［J］. 中国组织工程研究与临床康复, 2008, 12(15): 2926.
       
       ［6］Bassa BV, Noh JW, Ganji SH, et al. Lysophosphatidylcholine stimulates EGF receptor activation and mesangial cell proliferation: Regulatory role of Src and PKC［J］. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids，2007, 1771(11):1364.
       
       ［7］Welsh, C. F., Roovers, K., Villanueva, J., et al. Timing of cyclin D1 expression within G1 phase is controlled by Rho. Nat［J］. Cell Biol, 2001,3:950.