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       【摘要】 
       目的探讨羊耳菊不同器官水提取物的体外抑菌活性。方法以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌等10种微生物为试验菌株，采用药敏纸片扩散法、试管二倍稀释法，对羊耳菊水提取物进行抑菌试验。结果羊耳菊全株各器官都具有较强的抑菌作用，其中根对10种供试菌种都有抑制作用，抑制范围最广；茎对9种供试菌种有抑制作用，叶对8种供试菌种有抑制作用。羊耳菊各器官对金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌的抑制作用最强。羊耳菊根、茎、叶对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为15.63，62.5,62.5 mg/ml，而其抑菌圈直径分别为14.3，13.8,13.5 mm；羊耳菊根，茎，叶对铜绿假单胞菌的MIC值分别为15.63，31.25，62.5 mg/ml，其抑菌圈直径分别为15.8，15.5，14.0 mm。结论羊耳菊水提取物体外试验证实了该民间药物具有抗菌活性，也表明了羊耳菊是一种有开发潜力的新抗菌药物资源。
       【关键词】  羊耳菊；水提取物；抑菌作用；二倍稀释法；药敏纸片扩散法
       Studies on the Antimicrobial Activities of Aqueous from Inula cappa DC in vitro
       LIU Shenggui，LI Jun，CHEN Fucheng，LIU Xia , DENG Le
       1.College of Life Sciences , Hunan Normal University , Changsha，410081, China; 2.Department of Life Sciences , Huaihua University , Huaihua，418008, China
       Abstract：ObjectiveTo study the antibacterial activities of aqueous extracts from the different organs of Inula cappa DC.MethodsBy using a disk-diffusion and serial two-fold dilutions method, minimal inhibitory concentration (MIC) and inhibitory circle were determined in the plant extracts against 10 medically important bacterial strains.ResultsThe roots of Inula Cappa showed a stronger and broader spectrum of antibacterial activity. The roots of Inula Cappa showed a stronger and broader spectrum of antibacterial activity. The stems and the leaves inhibited 9,8 of 10 strains respectively. The MICs of the root, stem and leaf of Inula Cappa against Staphylococcus aureus were 15.63,62.5,62.5 mg/ml, and the diameters of the inhibition zone are 14.3,13.8,13.5 mm;and the MICs of the root, stem and leaves against Pseudomonas aeruginosa are 15.63,31.25,62.5 mg/ml, and the diameters of the inhibition zone were 15.8,15.5,14.0 mm. The aqueous extracts of the three organs of Inula Cappa DC had the weakest activities against Escherichia coli, Proteus vulgaris and Salmonella paratyphos.ConclusionThis in vitro study corroborated the antimicrobial activity of the selected plants used in folkloric medicine and also showed that Inula Cappa DC. can be potential sources of new antimicrobial agents.
       Key words：Inula cappa DC;  Aqueous extracts;  Antimicrobial activities;  Serial two-fold method;  Disk-diffusion method
        植物是药品生产的重要源泉，我国民间使用的药用植物引起了越来越多民族植物学家的重视，关于天然植物提取物抗菌活性的研究已经取得了许多成果［1，2］。羊耳菊Inula cappa DC.，系菊科旋覆花属植物，亚灌木，在我国南方分布较为广泛，主要生长在亚热带和热带的低山和亚高山的湿润或干燥的丘陵地、荒地、灌丛或草地，在酸性土、砂土和粘土上都常见，海拔500～3 200 m［3］。羊耳菊味苦微辛，性平无毒，全草或根花供药用［4］。经过调查了解，湖南通道县侗族民间常用其治疗疟疾、痢疾、风湿关节疼痛、泄泻、产后感冒、肝炎、痔疮和疥癣，中兽医也常用来治疗牛的痢疾。目前，国内、外尚没有关于羊耳菊抑菌作用的研究报道。本文研究表明，羊耳菊根、茎、叶各部分水提取物对病原菌有较强的抑制作用，为羊耳菊的药用开发提供了科学依据。
       1  材料
       1.1  试验样品 
       羊耳菊全株，于2006-12采自湖南通道侗族自治县，经湖南师范大学生命科学学院刘克明教授鉴定，标本收藏于怀化学院植物标本室。
       1.2  供试菌种 
       大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli  CVCC249)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus  CCTCCAB91053)，白色念珠菌(Candida albicans)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa )，普通变形杆菌(Proteteus vulgaris CCTCCAB91103)，鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella  typhi），鸡沙门氏杆菌(Salmonella gallinarium)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphosa)，以上菌种均由怀化学院微生物学实验室提供。
       1.3  培养基 
       LB(Luria-Bertani)液体基：蛋白胨10g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，用1mol/L NaOH调节pH 7.0，蒸馏水定容至1 000 ml。LB固体培养基：在LB液体培养基中加1.6%的琼脂粉。
       2  方法
       2.1  水提取物制备 
       羊耳菊水提取物制备方法按照文献［5］进行改进。将羊耳菊的根、茎、叶洗净，于60 ℃恒温箱中烘干至恒重，用组织粉碎机粉碎后20 目过筛。分别称取30 g根、茎、叶粉末，加入5倍体积的蒸馏水浸提24 h，每隔2～3 h搅拌混匀1次。浸提后过滤两次，上清液于8 000 r/min离心15 min，去除沉淀，并将药液浓缩至30 ml，相当于含生药1 g/ml，灭菌后4 ℃保存备用。
       2.2  菌悬液制备 
       将供试菌种分别接种在LB培养基上，37℃活化培养24 h，挑取活化后的菌落与无菌生理盐水中混合，并用生理盐水调至0.5 McFarland单位的标准接种物［6］，即为1～2×108 CFU/ml的菌悬液浓度。再用无菌生理盐水按10倍稀释法将标准接种物配成106 CFU/ ml的菌悬液。
       2.3  羊耳菊抗微生物活性试验 
       将滤纸打成直径为6 mm的圆形滤纸片，灭菌、烘干后放入羊耳菊根、茎、叶的水提取物中充分浸泡，取出后低温干燥，制成药敏纸片。吸取0.1 ml浓度为106 CFU/ ml的菌悬液于LB平板中央，用玻璃涂棒将菌液均匀涂布于平板上。含菌平板倒置干燥约30 min后，用镊子取药敏纸片均匀贴在平板上，每个平板贴3个药敏纸片。20 min后，放入37℃恒温培养箱中倒置培养24 h［7，8］。测量抑菌圈直径，以上实验重复3次。
       2.4   最低抑菌浓度（MIC）测定 
       在无菌条件下，将无菌试管分成3大组80支，80支试管再分成10小组，每组8支试管。第1支试管加入1 ml 2倍浓度的LB液体培养基，其余各支试管加入1 ml LB液体培养基，再向第1支试管中加入1 ml药液后按二倍稀释法，使各管中的药液浓度分别为0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25，0.015 60，0.007 8，0.003 9 g/ml。将培养物置于37℃恒温培养箱中培养24 h。观察培养物生长情况，测定MIC值［9］。以上实验重复3次。
       3  结果
       3.1  羊耳菊各器官抗微生物作用以三次重复试验的平均值计算植物提取物抑菌圈直径（包含药敏纸片部分）。结果见表1。表1  羊耳菊各器官对供试菌种的抑制作用（略）
        除大肠杆菌外,羊耳菊各器官提取物对所有试验菌都显示了抗菌活性。根、茎、叶提取物对铜绿假单胞菌抑菌作用最强，抑菌圈直径分别为15.8，15.5，14.0 mm；其次是金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌，对真菌白色念珠菌有较强的抑菌活性；但对大肠杆菌无抑制活性，对鼠伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏杆菌抑菌活性较弱。
       3.2  羊耳菊各器官的最低抑菌浓度（MIC）羊耳菊根、茎、叶对试验菌的抑制作用见表2～4。表2  羊耳菊根对供试菌种的抑制作用
       菌种不同羊耳菊根浓度实验结果（略）表3  羊耳菊茎对供试菌种的抑制作用（略）表4  羊耳菊叶对供试菌种的抑制作用（略）
        羊耳菊根对10种供试菌种都有抑制作用，抑制范围最广；羊耳菊茎对9种供试菌种有抑制作用；羊耳菊叶只对8种供试菌种有抑制作用，抑制范围略窄。总体来看，羊耳菊的抑菌谱比较广，而比较各器官的抑菌作用效果依次为为：根>茎>叶。
       
       从10种供试菌种来看，羊耳菊根、茎、叶提取物对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，其次是鼠伤寒杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和鸡沙门氏菌，羊耳菊根、茎、叶对铜绿假单胞菌的MIC值分别为：15.63，31.25，62.5 mg/ml；羊耳菊根、茎、叶对金黄色葡萄球菌的MIC值分别为：15.63，62.5，62.5 mg/ml。羊耳菊的各器官水提取物对真菌白色念珠菌也有较强的抑制活性，但对大埃希氏杆菌、甲型副伤寒沙门氏杆菌的抑制作用较弱。
       4  讨论
        由于抗生素的滥用，耐药性细菌引起的传染性疾病越来越来严重，寻找新的抗菌药物已成为药物研究的热点。从少数民族本土传统中草药中筛选新的抗菌药物是药物研究与开发的有效途径，并已取得了进展［2］。本实验使用的羊耳菊是湖南侗族人民常用药物，主要用于治疗痢疾、泄泻、肝炎、痔疮和疥癣，但国内、外文献均未对其抑菌作用研究报道。通过实验研究，进一步证实了其民间用羊耳菊治疗细菌性感染的科学依据，并为开发新的抗菌药物奠定了科学基础。
       
       由于水分子极性高，是糖类、糖蛋白、花青素、酚类化合物、生物碱等许多植物次生代谢物的良好溶剂，这些化合物可能是抗微生物的活性物质［10］。羊耳菊根、茎、叶水提取物具有良好的抗微生物作用，也说明民间使用羊耳菊煎煮汁治疗感染性疾病的科学性。
        本项研究使用药敏纸片扩散法和试管二倍稀释法分别测定了微生物抗菌活性，显示了两种试验结果相关性。药敏纸片扩散法结果取决于抗菌有效成分的溶解性和在琼脂培养基内的扩散性，是一种半定量的研究方法，是初步筛选抗菌植物有效途径。试管二倍稀释法则是一种精确测定抗菌活性的方法。
        本实验研究结果表明，羊耳菊对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌的抑制效果较强，但对大肠杆菌、变形杆菌、沙门氏杆菌的抑菌效果稍弱。这说明羊耳菊在治疗由金黄色葡萄球菌引起的肠炎、铜绿假单胞菌引起的肺炎和白色念珠菌引起的皮肤病等方面有较好的应用价值，但对由大肠杆菌、沙门氏菌引起的腹泻和肠道疾病则不适宜。
       【参考文献】
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       ［5］Jigna PAREKH，Darshana JADEJA，Sumitra CHANDA. Efficacy of Aqueous and Methanol Extracts of Some Medicinal. Plants for Potential Antibacterial Activity［J］.Turk J Biol，2005,29:203.
       
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