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青蒿花药培养研究
作者:伍晓丽,李隆云,钟国跃,刘飞    
作者单位:1.重庆市中药研究院,重庆 400065;2.重庆市中药良种选育与评价工程技术研究中心,重庆 400065

《时珍国医国药》 2009年 第12期

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       【摘要】 
       目的以青蒿花药为材料,进行诱导培养,获得了胚性愈伤组织,为青蒿单倍体植株的诱导奠定了基础。方法青蒿花药在进行不同时间的低温前处理后,置于含不同激素和蔗糖浓度的MS培养基上,再进行不同时间的高温后处理,然后转入25℃黑暗培养,统计愈伤诱导率。结果青蒿花药培养最适培养基是6-BA 1 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖3%或6-BA 1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖3%,无需低温前处理和高温后处理。结论可通过青蒿花药培养得到单倍体胚性愈伤组织。
       【关键词】  青蒿; 花药培养; 胚性愈伤组织; 单倍体; 正交设计
       Anther Culture of Artemisia annua L.
       WU Xiaoli, LI  Longyun,ZHONG Guoyue, LIU Fei
       1.Chongqing  Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065,China; 2.Chongqing Technological Research Center for Fine Varities Culture and Evaluation, Chongqing 400065, China
       Abstract:ObjectiveTo gain the Artemisia annua L. anther derived embryonic callus. MethodsTo pre-treat buds at the temperature of 4℃ for different hours,place them on the MS mediums containing different hormones and different concentration of sucrose ,and before culturing the buds at the temperature of 25℃ in the darkness,preculture them at 33℃ for different hours. Record the rate of induction two weeks later.ResultsThe most suitable mediums were  MS+6-BA 1 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L+ sucrose 3% or MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.3 mg/L+ sucrose 3% without any pre-treatment with low temperature or post-treatment with high temperature. ConclusionEmbryonic callus can be derived from Artemisia annua L. anther.
       Key words:Artemisia annua L.;   Anther culture;   Embryonic callus;   Haploid;   Orthogonal design
       
       青蒿Artemisia annua L.为菊科一年生草本植物。青蒿性寒味苦,为传统清热解毒药物,有效成分青蒿素(Artemisinin)具有高效、速效和低毒的抗疟性能,对脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾患者疗效更为显著,是重要出口创汇药物。然而,自然界青蒿素产量低,生产周期长,受自然环境影响大;用人工有机合成工艺复杂,产量低,毒性大[1];人们转而利用生物工程技术,如细胞悬浮培养[2]、利用Ri质粒转化的青蒿发根培养生产青蒿素[3]等,但成本高,生产效率较低,不能大量供应实际需求。因此,选育高青蒿素含量的优良品种不失为解决供求矛盾的一条可行途径。本实验研究了通过青蒿花药培养得到单倍体愈伤组织的方法,进而再生单倍体植株,通过单倍体植株的加倍即可在短时间内获得纯合的二倍体植株。该途径为优良种株的快速选育奠定了技术基础。本研究国内尚属首次进行。
       1  材料与方法
        青蒿处于单核晚期的花蕾,基本培养基为MS培养基。
       2 方法
        花蕾75%乙醇消毒2 min,次氯酸钠加一滴吐温浸泡材料10 min,无菌水洗6次,显微镜下剥出花药,接种于诱导培养基,黑暗培养。每处理10瓶,每瓶50枚花药。
       2.1  实验设计本实验包括如下因素的处理:
       2.1.1  激素水平①MS+6-BA 1 mg/L+2,4-D 0.1 mg/L; ②MS+6-BA 1 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L;③MS+6-BA 1 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L;④MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L;⑤MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.3   mg/L;⑥MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.5 mg/L;⑦MS无激素。
       2.1.2  蔗糖浓度3%;8%;13%。
       2.1.3  离体花蕾4℃低温前处理时间0,24,48 h。
       2.1.4  接种后33℃高温后处理时间0,24,48 h。以上处理激素的①②③同后3个因素一起作L(3)4正交设计。见表1。表1  正交设计(略)
       2.1.5  其余4种培养基上接种材料的处理均低温前处理48 h,高温后处理24 h,培养基添加蔗糖3%。
       2.2  细胞染色和染色体观察取少量愈伤组织,醋酸洋红液染色,镜检观察细胞核;另取少量愈伤组织,0.2%秋水仙素处理2 h,卡诺氏固定液固定6 h,盐酸:酒精液解离5 min,洗净,卡染液染色5 min,镜检观察染色体。
       3  结果
        2周后,观察愈伤发生情况,发现部分处理诱导出愈伤组织如图1,细胞染色发现愈伤组织细胞核大,占据绝大多数细胞内空间,如图2所示,可见是胚性细胞。染色体观察记数如图3。共计9条染色体,为单倍体细胞,愈伤诱导率结果见表2。表2  愈伤诱导情况(略)
        
        在解剖镜下观察愈伤组织,发现愈伤上已开始分化出芽状组织,如图4圆圈所示;另外,培养基上还发现有少部分单独的芽状物,它们未依于愈伤独立存在,如图5所示。对正交实验的结果进行极差分析法。结果见表3。表3  极差分析结果(略)
        从以上结果可看出,激素因素:Ⅱ>Ⅰ> Ⅲ,说明激素6-BA一定时,2,4-D过高和过低对于愈伤组织形成都不利,尤其是过高,愈伤诱导率大大下降;蔗糖浓度:Ⅱ>Ⅰ> Ⅲ,但蔗糖3%和8%的愈伤组织诱导率相差不大,说明蔗糖浓度在3%~8%范围内均可,但13%时愈伤诱导率急剧下降,可见蔗糖浓度过高不利于愈伤诱导;低温前处理:Ⅰ> Ⅲ>Ⅱ,可见不进行低温前处理有利于愈伤诱导,但为什么低温前处理48 h愈伤诱导率反高于低温前处理24 h,则难以进行解释;高温后处理:Ⅰ> Ⅲ>Ⅱ,可见不进行高温后处理利于愈伤诱导,而高温后处理48小时反优于24 h,情况类同于低温前处理。根据各因素的极差R看,低温前处理时间>高温后处理时间> 蔗糖浓度>激素,即各因素对结果的影响从左到右依次减弱。最佳组合为6-BA 1 mg/L+2,4-D 0.3 mg/L+蔗糖3%,无需低温前处理和高温后处理。
       
       接种于培养基④⑤⑥⑦上的材料,诱导率⑤>④>⑥>⑦,说明激素的存在对于愈伤的诱导是必不可少的,而在6-BA一定的情况下,NAA浓度不宜过高和过低,尤其是过高,对于愈伤诱导不利。
        ⑤同正交处理的E相比,⑤       4  讨论
        花药愈伤诱导的影响因素很多,包括培养方式、基因型、激素种类和浓度、活性炭与有机附加物、植物、基本培养基种类、生理状态、花药发育时期、预处理等,本实验仅比较了激素、蔗糖浓度、低温前处理和高温后处理等4个因素,初步探索出了青蒿花药培养的实验条件。从以上分析可看出,激素的存在对于愈伤诱导必不可少,在6-BA一定的条件下,2,4-D和NAA浓度过高和过低均不利于愈伤诱导,尤其是浓度过高;此外,蔗糖浓度也不宜过高,蔗糖在培养基中还起着调节渗透压的重要作用,由于不同植物花粉细胞的渗透压不同,因此对蔗糖浓度的要求也不同,本实验研究,青蒿花药培养蔗糖浓度可在3%~8%之间,从节约成本考虑,宜用3%;低温可以改变纺锤丝的轴向,破坏纺锤丝的微管蛋白,从而阻止纺锤丝形成,使有丝分裂的正常过程被打破,导致分化过程的发生:且低温可以在一定程度上抑制花药离体后小孢子的衰败,使小孢子存活的时间延长,从而有更多的小孢子启动雄核发育。大量文献报道,对离体花蕾进行0℃以上低温预处理有助于花粉愈伤的诱导[4],也有低温预处理起到负面效果的报道[5],本研究的结果表明,低温预处理对于青蒿花药培养具有负面作用。连勇等[6]的研究表明变温处理,即在高温下预处理一段时间后再到低温中培养,有于提高胚状体的诱导频率。一般认为,在33~36℃下处理若干天后转入25℃下培养,且均在黑暗条件下培养,愈伤组织诱导效率更高。而本研究表明,高温后处理对青蒿花药培养具负效应。
        花粉的发育时期对于愈伤诱导至关重要,本研究在取材前,先取花粉染色观察,确定其处于单核晚期,再取材。否则,取材过早或过晚,都可能无法诱导出愈伤。
        目前,愈伤组织已转入分化培养基,关于分化培养条件,见后续报道。
       【参考文献】
           [1]石开云,梅 林,蔡中文,等.青蒿素前体研究进展[J].中国药业,2007,16(10):25.
       
       [2]王玉春, 叶和春. 青蒿毛状根悬浮培养动力学及其计量关系[J].化工冶金,2000, 21(1):42.
       
       [3]刘本叶,叶和春. 发根农杆菌转化青蒿影响因素的研究[J].应用与环境生物学报,1998, 4(4):349.
       
       [4]张日清,闻 丽,刘友全,等.低温预处理对油茶花药愈伤组织诱导的影响[J].中南林学院学报,2005,25(6):24.
       
       [5]褚云霞,陈龙靖.百合的花药培养研究[J].园艺学报,2001,28(5):472.
       
       [6]连 勇,刘富中,陈钰辉,等. 茄子体细胞杂种游离小孢子培养获得再生植株[J].园艺学报,2004,31(2):233.

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