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       【摘要】 
       目的探讨姜黄素3种不同给药途径对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。方法通过噻唑蓝（MTT）比色法比较姜黄素3种给药途径对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。结果姜黄素体内给药和含药血清能够促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，体外实验证实姜黄素能够抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖，并呈量效关系。结论姜黄素与其代谢产物对淋巴细胞增殖作用的影响是相反的。
       【关键词】  姜黄素； 淋巴细胞； 含药血清
       The  Effect  of Curcumine  Administration in Vivo or Vitro and  its  Drug Serum  on  the  Proliferation  of  Spleen  Lympholeukocytes 
       FENG Wenru,     ZHAO Xiumei,LIU Liping, HU Renjie
       （Tianjin  Institute of Medical and Pharmacological Sciences，Tianjin   300020 China）
       Abstract：ObjectiveTo probe into the hyperplasy effect of different curcumine administered approaches for the splenic lymphocyte of mice.MethodsThe effect of curcumine on the proliferation of spleen lymphocytes through three different administration routes were determined with MTT test. ResultsCurcumine administrated in vivo and its drug serum upregulated the proliferation of spleen lymphocytes.Out-of-body experience certified curcumine could suppress the hyperplasy of the mice splenic lymphocyte. It presented dose-effect relationship. ConclusionIt is contrary that the effect of curcumine and its metabolite on the proliferation of spleen lymphocytes.
       Key words：Curcumin  ;  Lymphocyte;  Drug serum
       
       姜黄素是中药姜黄的主要成分，有很重要的经济价值和广泛的药理作用。如抗氧化、抗炎、降血脂、抗肿瘤等［1］。近些年来有关姜黄素生物活性的研究越来越多。体外实验证实姜黄素具有免疫调节的作用［2］，但其对体内给药的免疫调节的作用未见报道。本文通过体内外及血清药理学的对比实验着重对此进行了研究观察，以期为进一步研究其免疫药理作用提供实验依据。
       1  材料
       1.1    动物ICR小鼠 雌性，体重 18～20 g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，实验动物合格证编号：0034800。
       1.2   试剂与仪器RPMI1640，批号1285082，GIBCO公司产品；刀豆蛋白（ConA），Sigma 公司提供；四甲基偶氮唑蓝（MTT），北京欣经科生物技术有限公司产品，批号：T15051/15181；姜黄素，由本所植化室提供；小牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司产品，批号：061201。CO2孵箱，REVCO；电子天平，METTLER，AE240；96孔板，由greiner bio-one  提供；酶标仪，well scan MK3 Labsystems Dragom。
       2  方法
       2.1   姜黄素体内对小鼠脾淋巴细胞转化的影响ICR小鼠60只，分为5组，即正常对照组和姜黄素4个剂量组，对照组每日灌胃生理盐水，姜黄素给药组分别每日灌胃给药50，100，200和400 mg/kg的姜黄素。连续给药7 d，于末次给药后，取各种小鼠脾脏无菌制备单个脾细胞悬液，调整细胞浓度为4×106/ml，置于96孔板中，并增设ConA对照组（浓度为5 μg/ml），该组细胞悬液取自正常对照组。取每只小鼠的脾细胞悬液75 μl加入96孔板中，并设4个复孔。除正常对照组，其余各组均加入25 μl ConA；随后，正常对照组加入125 μl RPMI1640培养液，其余各组各孔均加入RPMI1640培养液100 μl，使反应总体积为200 μl/孔。置5%CO2孵箱37℃培养72 h，培养结束前4 h，每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h，培养结束后，1 000 r/min离心10min，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，充分振荡后室温静置10 min。进行酶标仪检测，读取A570nm值。
       2.2  姜黄素体外对小鼠脾淋巴细胞转化的影响在无菌条件下，常规制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为4×106/ml，然后按实验分组：细胞对照组、ConA对照组、ConA＋姜黄素组。将新分离的小鼠脾细胞悬液加入96孔板中，各组均加入细胞悬液75 μl/孔，ConA对照组和ConA＋姜黄素组加ConA 25 μl/孔。然后ConA＋姜黄素组加入含有不同浓度姜黄素（0.88，1.76，3.52，7.03，14.06，28.13，56.25，112.5，225 μg/ml）的RPMI1640培养液100μl/孔。设4个复孔。姜黄素药物对照组加入含上述不同浓度姜黄素的RPMI1640培养液100 μl，再加入RPMI1640培养液100 μl。细胞对照组和ConA对照组分别加入RPMI1640培养液，使反应总体积为200 μl/孔。加样完毕置5%CO2孵箱37℃培养72h，培养结束前4 h，每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h，培养结束后，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，每孔加入150 μlDMSO，充分振荡后室温静置10 min。进行酶标仪检测，读取A570 nm值。
       2.3  姜黄素含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
       2.3.1  含药血清的制备 ICR动物20只，分为5组，每组4只，即正常对照组和姜黄素50 ，100，200和400 mg/kg，对照组灌胃生理盐水，给药组灌胃不同浓度的姜黄素， 0.2 ml/10 g体重，连续给药5 d，末次给药后1，2和4 h摘眼球无菌取血，3 000 r/min离心10 min，无菌分离血清后，每组合并血清，经56℃ 30 min 灭活，-20℃保存，1个月内使用。
       2.3.2  淋巴细胞增殖活性的测定无菌制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为4×106/ml，按上“含药血清的制备”分组进行加样。参照文献［3］，于96孔培养板每孔加入100 μl脾细胞悬液，再加入80 μl ConA（2.5 μg/ml）及20 μl不同时相含药血清，使每孔含药血清的含量为10%，设4个复孔。对照组加入相应体积的无药血清培养。加样完毕置5%CO2孵箱37℃培养72 h，培养结束前4 h，每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml)，继续培养4 h，培养结束后，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，每孔加入150 μl DMSO，充分振荡后室温静置10 min。进行酶标仪检测，读取A570 nm值。
       2.4   统计学分析数据以±s表示，用t检验统计。
       3  结果
       3.1   姜黄素体内对小鼠脾淋巴细胞转化的影响实验结果见表1。由表1可见，姜黄素在50，100，200和400 mg/kg之间，在ConA的诱导下，随着药物浓度的增加，增殖活性也在逐渐增加，基本呈量效关系。
       表1  姜黄素体内对小鼠脾淋巴细胞转化的影响（略）
       3.2   姜黄素体外对小鼠脾淋巴细胞转化的影响由表2 可见，姜黄素体外实验各给药组与ConA组比较，在浓度为0.88～3.52μg/ml时，除浓度0.88μg/ml似有促进增殖作用（无统计学意义）外，基本可以看出在该浓度范围姜黄素对淋巴细胞增殖作用无明显的影响。姜黄素在浓度7.03～225μg/ml之间时则表现出明显的抑制ConA诱导的脾淋巴细胞增殖的作用，该抑制作用基本上呈剂量依赖性。
       表2  姜黄素体外对小鼠脾淋巴细胞转化的影响（略）
       与ConA对照组比较，※ P＜0.01
       3.3  姜黄素含药血清对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响由表3可见，姜黄素含药血清浓度为10%时，400 mg/kg组与ConA对照组比较1，2 h时相未表现出增殖活性，4 h时增殖活性明显。50～200 mg/kg组与对照组比较，1，2和4 h 时均表现出明显的增殖活性， P＜0.01。
       表3  姜黄素体外对小鼠脾淋巴细胞转化的影响（略）
       与对照组比较，※P＜0.01
       4  讨论
       
       维持机体免疫功能主要依赖于各种功能正常的免疫细胞和细胞之间的相互作用。其中T淋巴细胞多数寄居在脾脏，参与细胞免疫，是特异性免疫应答的基础［4］。本实验通过3种作用途径观察姜黄素对淋巴细胞转化功能的影响。姜黄素口服给药50，100，200和400 mg/kg这4个剂量组的脾淋巴细胞，在ConA的诱导下，随着药物浓度的增加增殖活性也在增加，说明姜黄素口服给药可以提高机体的特异性免疫功能。姜黄素体外实验表明，姜黄素在0.88～3.52 μg/ml时，对ConA诱导的脾淋巴细胞的增殖无影响，在浓度7.03～225 μg/ml之间明显的抑制了ConA诱导的脾淋巴细胞的增殖，与文献报道的结果相近［2］。根据文献报道［5］，我们采集了姜黄素口服末次给药后1，2，4 h的血，分离出血清，在体外实验中，姜黄素含药血清表现出一定的增殖活性与体内实验结果相一致。
       
       姜黄素体内外实验结果相佐，即姜黄素体外表现出强烈的细胞毒活性，而体内（包括含药血清）表现出明显地促进淋巴细胞增殖的活性，提示姜黄素口服后可以吸收，通过吸收入血后发挥其药理作用；口服姜黄素所产生的体内免疫增强作用其物质基础很可能不在于姜黄素本身而是其相应的代谢产物。有关姜黄素的药代动力学实验研究表明，姜黄素的血药浓度低或基本测不到，生物利用度不高，可能与其吸收、代谢有关。口服姜黄素在小肠吸收时有生物转化（与葡萄糖醛酸，硫酸结合，还原为四氢姜黄素和六氢姜黄素），但结合和还原的比例还不明确。在肝中也有姜黄素结合或还原产物。姜黄素主要是在小肠还是在肝中进行的生物转化及转化产物的作用尚未确定［5］。
       
       总之本项研究表明，姜黄素与其“代谢产物”有着不同的生物活性，体外姜黄素表现出明确的细胞毒活性［2］，而其“代谢产物”的细胞毒活性“消失”。我们另一项实验结果证实，与姜黄素本身比较它的含药血清不具有抗肿瘤增殖的生物活性。同时，本实验结果尚可证实，姜黄素口服给药在体内最终发挥生物作用的是其代谢产物而非原型药物，当然这一结论的确证最终尚需进一步证实。
       
       此外，通过本项实验观察进一步验证了中药体内给药与其含药血清体外实验结果的一致性，即含药血清体外实验结果与体内实验结果相符合。4h采集的含药血清诱导小鼠脾细胞增殖的活性明显高于1和2 h采集的血清，这一现象与一般认为大多含药血清采集在1～2 h（多数药物口服给药后达峰时间）活性较强不符［6］，结合文献资料单次口服姜黄素达峰时间为0.75～1 h［5］，进一步提示姜黄素体内免疫增强（调节）作用来自其代谢产物而非其本身。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会. 中国药典［S］.北京:化学工业出版社,2000:218.
       
       ［2］ 李新建,刘晓城. 姜黄素调节小鼠免疫功能的实验研究［J］. 中国组织化学与细胞化学杂志,2005,14（2）:132.
       
       ［3］ 梁春敏,王贤喜. 玉屏风散对小鼠免疫调节作用的血清药理学研究［J］. 上海免疫学杂志,2003,23（6）：385.
       
       ［4］ Bielak-Zmijewska A, Koronkiewicz M,Skierski J, et al. Effect of curcumin on the apoptosis of rodent and human nonproliferating lymphoid cells［J］. Nut Cancer,2000,38:131.
       
       ［5］ 王 旗，王 燮. 姜黄素的代谢研究［J］. 中国药理学通报，2003，19(10):1097.
       
       ［6］ 刘建文. 药理实验方法学-新技术与新方法［M］. 北京:化学工业出版社,2003: 258.