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       【摘要】 
       目的研究验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞株细胞增殖、酪氨酸酶活性和黑素合成的影响，探讨验方治疗黄褐斑的作用机制。方法四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定验方对细胞增殖的影响，用酶学方法测定对酪氨酸酶活性的影响，475nm比色法测定验方对黑素含量的影响。结果验方祛斑汤对体外培养的A375人黑素瘤细胞具有抑制细胞增殖，降低酪氨酸酶活性和黑素含量作用。结论该方能抑制黑素细胞黑素合成，这可能是其治疗黄褐斑的作用机制之一。
       【关键词】  验方祛斑汤； 人黑素瘤细胞； 黑素合成； 黄褐斑
       Effects of Proved Recipe Quban Soup on Melanogenesis in A375 Human Melanoma
       LIU Bangmin，ZHANG Juan，TAO Chunrong，SU Yongmei，AI Rudi*
       （Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China Shaanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xianyang  712046, China; Chongqing Medical University, Chongqing 400050 China）
       Abstract：ObjectiveTo study the effect of proved recipe Quban soup on cell proliferation, tyrosinase activity and the melanogenesis of A375 human melanoma cell and to explore the mechanism of them on treating chloasma. Methods MTT was used to study the proliferation of A375 human melanoma cell. Tyrosinase activity was measured by zymologic method. The melanin was detected by its absorption at 475nm. ResultsProved recipe Quban soup had the effects of inhibiting the proliferation, and decreasing tyrosinase activity and melanin content of A375 human melanoma cell in vitro. ConclusionThe recipe is effective in the treatment of chloasma by inhibiting the melanogenesis of A375 human melanoma cell.
       Key words：Proved recipe Quban soup;   Human melanoma;   Melanogenesis ;  Chloasma
       
       黄褐斑是一种发于颜面部的色素沉着性皮肤病，其病机主要与肝、脾、肾有关。导师艾儒棣教授以滋补肝肾、益气养血、活血化淤为治则，研制了验方祛斑汤，临床治疗黄褐斑取得了较好疗效。我们研究该方对体外培养人A375黑素瘤细胞的细胞形态、细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素含量的影响，以探讨其作用机制。
       1    材料和方法
       1.1   细胞株及来源  人A375黑素瘤细胞株由四川大学华西医学中心免疫实验室提供。
       1.2  主要试剂及仪器  左旋多巴（L－DOPA）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）；RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco公司）；Triton X-100（上海华美生物工程公司）。CO2培养箱（德国Heraeeus公司）；酶标仪（Model 550：Bio-RAD）；倒置显微镜（德国LECIA公司）。
       1.3   药物及制备方法  验方祛斑汤（主要组成药物：黄芪、菟丝子、当归、川芎、白芍、熟地等）的中药饮片均购自成都市太极大药房。制备方法［1］：取中药加相当于药材量10倍的蒸馏水浸泡2 h，第1次回流提取1.5 h，滤过后药渣再加10倍量水继续提取1 h，合并两次滤液，离心去渣，文火煎至糊状，加20ml无菌1640液，调pH值至7.2。沉淀后吸上清液抽滤除菌，置-20℃冰箱备用。中药母液浓度为1 g/ml，临用时用新鲜培养基稀释至终浓度为：0.01，0.05，0.1，0.5，1 mg/ml。熊果苷:阳性对照组用药由成都万和生物工程有限公司赠。终浓度调至为：0.1，0.5，1，5 mmol/L。
       1.4   方法
       1.4.1   人A375黑素瘤细胞培养  无菌条件下，将细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基的培养瓶中，在37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养，每3天用0.25%胰酶消化传代1次，实验用第3～4代细胞。待细胞生长到对数期，用PBS洗涤，0.25%胰酶消化，细胞计数板计数，然后接种至细胞培养板待测。
       1.4.2   细胞增殖的测定  采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）［2］：取对数生长期细胞，常规胰酶消化处理后吹打成单细胞悬液，将细胞浓度调为5×104个/ml，接种于96孔板，每孔100μl。在37℃，5%CO2培养箱中培养24 h后，弃去上清液，分别加入含不同药物浓度的培养基，每孔100 μl，阳性对照组为含不同浓度熊果苷的培养基，空白对照组加不含药物的培养基，继续培养48 h后，每孔加入MTT液20 μl（5 mg/ml），继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μl，振荡10 min左右，于酶标仪570 nm波长处测定A值。每一浓度设6个复孔，实验重复3次，取平均值。同期在光镜下观察细胞的形态变化。细胞增殖抑制率（％）＝（1－加药组A570nm/空白组A570nm）×100％。
       1.4.3   酪氨酸酶的活性测定［3］  同上细胞培养方法和分组原则，培养48 h后，用0.01M,pH7.2的PBS洗涤两次，每孔加入1％Triton X-100溶液50 μl，迅速置－80℃冻存30 min，随后室温融化使细胞完全破裂，37℃预温后加入1％L－DOPA溶液10 μl，37℃反应2 h，于酶标仪490 nm波长处测定A值。每一浓度设6个复孔，实验重复3次，取平均值。酪氨酸酶活性抑制率（％）＝（1－加药组A490nm/空白组A490nm）×100％。
       1.4.4  　黑素含量的测定　采用Hunt法［4］ ，酶标仪475 nm波长处测定A值。每一浓度设4个复孔，实验重复3次，取平均值。黑素相对含量=加药组A475nm /空白组A475nm×100%。
       1.4.5   统计学处理实验数据以±s表示，组间差异的显著性检验运用SPSS 12.0软件提供的单因素方差分析方法，若方差齐性，与对照组比较用Dunnett-t法检验；若方差不齐，用Dunnett-T3法检验。
       2    结果
       2.1   验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞形态的影响空白对照组细胞分布均匀，形态以梭形为主，双极或三极贴壁生长；验方祛斑汤浓度＜0.1mg/ml时，细胞生长良好，分布均匀，当浓度＞0.1 mg/ml时，可见部分细胞树突缩短或消失，贴壁细胞数量减少，1 mg/ml组细胞形态变化尤为明显，部分细胞脱壁变圆，贴壁细胞数量与对照组比较明显减少；熊果苷组亦见细胞脱壁变圆，贴壁细胞数量减少。
       2.2   验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞增殖的影响 由表1可见，验方祛斑汤组在浓度低于0.1mg/ml时，对A375细胞增殖有微弱的抑制作用，随着浓度增加抑制率逐渐增加，在0.1～1mg/ml时，呈明显的剂量依赖性,与空白对照组比较，差异明显（P＜0.01）；熊果苷组对细胞增殖也有明显抑制作用（P＜0.01）。
       表1  验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞增殖的影响（略）
       与空白对照组比较，**P＜0.01；n=18
       2.3   验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响由表2可见，验方祛斑汤浓度在0.01～1.00 mg/ml时，对酪氨酸酶活性均有抑制作用，其中在0.1～1.0 mg/ml范围时，与空白对照组比较有差异（P＜0.05或 P＜0.01）；熊果苷组在1 mmol/L和5 mmol/L时，对酪氨酸酶活性抑制明显（P＜0.05或 P＜0.01）。
       表2  验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞酪氨酸酶活性的影响（略）
       与空白对照组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；n=18
       2.4   验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞黑素含量的影响由表3可见，验方祛斑汤组在浓度低于0.5 mg/ml时，对A375细胞黑素合成有微弱的抑制作用，与空白对照组比较，无统计学上有意义的差异（P＞0.05），0.5 mg/ml和1 mg/ml时，与空白对照组比较，差异明显（P＜0.05或 P＜0.01）；熊果苷组对细胞黑素合成也有明显抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。
       表3  验方祛斑汤对A375人黑素瘤细胞黑素含量的影响（略）
       与空白对照组比较，*P＜0.05,**P＜0.01；n=12
       3   讨论
          
       黄褐斑作为一种色素增加性皮肤病，黑素生成过多是其根本原因。一般来说，对黑素细胞胞内抑制主要通过直接抑制合成过程中所需的各种酶，其中最重要的是酪氨酸酶（TYR）。本实验结果表明，验方祛斑汤呈剂量依赖性抑制A375人黑素瘤细胞的生长，同时抑制细胞TYR活性，降低细胞内黑素含量，且在一定范围内药物的浓度越高，作用越明显。这提示验方祛斑汤治疗黄褐斑可能是通过抑制TYR活性减少黑素合成起作用的。但黑素生成是一个复杂的代谢过程，对于黑素生成有抑制作用的药物可能作用于多个环节，本方可能通过多条途径抑制黑素合成，其他作用机制有待于今后实验的进一步研究。
       【参考文献】
         　　［1］ 张美华，朱文元.48种中药对体外培养黑素细胞瘤细胞黑素形成的影响［J］.江苏中医，1999，20(5)：44.
       
       ［2］ 司徒镇强，吴军正.细胞培养，第1版［M］.西安：世界图书出版社，2004：79，199.
       
       ［3］ 程东庆，尉晓冬，王遂全，等.复方中药对小鼠B－16黑素瘤细胞株黑素合成和酪氨酸酶的激活作用［J］.中华皮肤科杂志，2000，33(3)：173.
       
       ［4］ Hunt G, Todd C, Cresswell JE, et al. α-Melanocyte stimulating hormone and its analogue NIe4DPhe7α-MSH affect morphology, tyrosinase activity and melanogenesis in cultured human melanocytes［J］.Journal of Cell Science, 1994, 107：205.