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       【摘要】 
       目的确定瓶尔小草的最佳采收季节。方法对夏（8月）、秋（10月）、冬（12月）三季节采收的瓶尔小草中的总黄酮进行了提取，以芦丁为对照品，用紫外分光光度法对其含量进行了测定。结果不同季节采收的瓶尔小草中黄酮类化合物的含量有着显著的差异，夏季（8月）其含量为58.42(mg/g DW)，秋季（10月）为39.32(mg/g DW)，冬季（12月）为28.14(mg/g DW)。结论瓶尔小草的最佳采收季节应为每年8月。
       【关键词】  瓶尔小草； 黄酮类化合物； 紫外分光光度法
       Flavonoids Content in Ophioglossum vulgatum L.
       ZHAO Baofa，  ZHANG Zhixin*，ZHANG Shixiu，HUANG Baogui， MU Jianhua
       （Department of  Biochemistry,Wenshan Normal  College, Wenshan, Yunnan 663000，China）
       Abstract：ObjectiveTo study the best harvest season of Ophioglossum vulgatum L..MethodsThis paper reported the extraction and the preliminary determination of flavonoids in Ophioglossum vulgatum L. from the samples of August, October, December by UV-spectrophotometry with rutin as comparison sample.ResultsThe contents of flavonoids had significant difference in Ophioglossum vulgatum L. at different seassons. The highest flavonoid content in Ophioglossum vulgatum L. of August was 58.42(mg/g DW) and the contents of the sample in June was 39.32(mg/g DW),and the content of the samples in December was 28.14(mg/g DW).ConclusionThe best harvest seasson for Ophioglossum vulgatum L. is August.
       Key words：Ophioglossum vulgatum L.；  Flavonoids；  UV-spectrophotometry
       
       瓶尔小草科植物瓶尔小草Ophioglossum vulgatum L.又称一支箭、一支枪、独叶一支箭、单枪一支箭、一矛一盾、矛盾草、蛇须草。以全草入药，功能清热解毒，消肿止痛。用于小儿肺炎、脘腹胀痛、毒蛇咬伤、疔疮肿毒；外用治急性结膜炎、角膜云翳、眼睑缘炎。分布于东北、陕西、湖北、云南、贵州、广西、台湾及长江下游等地［1，2］。
       
       黄酮类化合物广泛存在于植物中，生理活性作用广泛：维持血管正常的渗透压、防止血管脆化，对多种炎症、冠心病、心绞痛等均有良好的疗效。同时，黄酮类化合物还是一种良好的活性自由基清除剂，具有调整免疫和内分泌作用，还有抗癌、抗炎等多种医疗保健作用，是一类重要的生物活性因子。瓶尔小草的叶中主要含3-O-甲基槲皮素-7-O-双葡萄糖苷-4"-O-葡萄糖苷，其功效与黄酮类化合物有着密切关系。本研究探讨了瓶尔小草中总黄酮Total flavones of Ophioglossum vulgatum L.（FOV）的提取、测定,分析了瓶尔小草中总黄酮随季节的变化，以期为充分利用瓶尔小草资源提供实验依据。
       1  器材
       1.1  仪器UV-160紫外分光光度计（日本岛津）；AEL-40SM十万分之一天平（日本岛津）；干燥箱CS-101-2CS（重庆实验仪器厂）；微波炉，Midea PJ21F-B(C2)。
       1.2  试剂芦丁对照品购于中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯。
       1.3  药材瓶尔小草全株于2006年8，10，12月采集于云南文山县杨柳井，经云南文山师范高等专科学校沐建华讲师鉴定，每次采样3次重复。
       2  方法
       2.1  标准曲线的制作［3］精密称取120℃干燥至恒重的芦丁对照品10 mg用20 ml乙醇溶解后，转移到100 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀即得（每毫升溶液中含无水芦丁0.1 mg）。精密吸取芦丁标准液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0 ml。分别置于50 ml容量瓶中，各加水至12 ml，加5%NaNO2溶液2 ml，混匀，放置6 min,加10%Al(NO3)3溶液2 ml，混匀，放置6 min,加4%NaOH 20 ml,再加水至50 ml，放置15 min,以不加芦丁对照品的试剂作空白对照。按分光光度法［4］在503 nm（全波长扫描，在503 nm处有最大吸收）波长处测定吸光度。以所取标准液含有的芦丁标样量mg数和吸光度数据经回归处理，得到回归方程,回归方为程：Y=0.219 6X-0.011 2，相关系数r=0.999 3。
       2.2  黄酮类化合物的提取和测定方法［5］瓶尔小草粉碎（过60目筛），称取5 g，用70%乙醇溶液为溶剂，浸泡24 h，微波提取10 min（微波加热2 min，间隔1 min，用于补充溶剂损耗），抽滤，提取液用70%乙醇溶液定容至200 ml，取1 ml按“2.1”项下方法测定吸光度，根据回归方程计算出1 ml提取液中的总黄酮的mg数，按下式计算瓶尔小草中的黄酮含量(mg/g DW)。
       
       样品中的总黄酮含量（以芦丁计）：  总黄酮含量（mg/gDW）=200CW
       
       式中：C为1 ml样品液含总黄酮量(mg)，W为样品的质量(g)。
       2.3  回收率的测定准确称取夏季采收的瓶尔小草样品5 g，共3份，分别加入一定量的芦丁对照品，按“2.2”操作。用紫外分光光度计测定吸光度，得出总黄酮含量，根据回收率公式计算出回收率。
       
       回收率（%）=混合后测得总黄酮含量-样品中总黄酮含量芦丁对照品加入量×100%
       2.4  精密度实验精密称取夏季瓶尔小草干粉样品5 g，共6份，按“2.2”测定。
       3  结果
       3.1  提取溶剂乙醇浓度的选择对于总黄酮的提取率与醇溶液的浓度及黄酮类型的不同而有所差异，因此本实验做了乙醇浓度对黄酮类化合物提取率的影响的实验。取不同浓度的乙醇溶液对不同季节的瓶尔小草干粉，按照“2.2”项下方法分别提取和测定。结果见表1。
       表1  乙醇浓度对FOV提取的影响（略）
       由表1可以看出，乙醇浓度为70%时，提取液中黄酮类化合物的提取率最高。本实验选择70%的乙醇为溶剂。
       3.2  微波提取次数实验将经过“2.2”项下操作过滤后的残渣，重复“2.2”项下操作两次，过滤后分别收集各部滤液，并按照“2.1”项下方法测定各部滤液的吸光度。结果见表2。
       表2  微波提取次数对FOV提取的影响（略）
       从表2可以看出，对样品提取2次，不同季节的瓶尔小草中的黄酮类化合物提取完全。本实验选择微波提取2次。
       3.3  黄酮类化合物含量的测定分别称取不同季节的瓶尔小草干粉3份，每份5 g，按“2.1”和“2.2”项下方法进行提取和测定。结果见表3。
       
       从表3可以看出，夏、秋、冬季节的瓶尔小草中，以夏季瓶尔小草中的黄酮类化合物含量最高，若对瓶尔小草中的黄酮类化合物开发利用，应该选择夏季进行采收。3.4  样品回收率实验结果见表4。由表4可以看出本实验的平均回收率为99.30%，相对标准偏差（RSD%）为2.457%。
       表3  不同季节FOV的含量（略）
       表4  回收率实验结果（略）
       3.5  精密度实验结果见表5。从表5可以看出，相对标准偏差为0.647%，结果显示重复性较好，精密度较高。
       表5  精密度实验结果（略）
       4  讨论
       4.1  瓶尔小草黄酮类化合物含量的变化随季节的不同，瓶尔小草的黄酮类化合物的含量有着显著的差异，夏季其含量为58.42 mg/g DW，秋季为39.32 mg/g DW，冬季为28.14 mg/g DW。说明夏季是瓶尔小草黄酮类化合物含量最高时期即最佳采收期，这与瓶尔小草夏末秋初采收相符。这可能因为从开春到夏季，随着植物生长逐渐变得旺盛，其代谢活动也愈来愈旺盛，总黄酮含量呈现上升趋势，到夏季达到高峰；到了秋、冬季节，气温降低、气候干燥，其代谢受到抑制，瓶尔小草茎叶逐渐变黄枯萎，故从夏季到秋季，再到冬季，其总黄酮含量呈下降态势［6］。
       4.2  提取测定方法稳定可靠以芦丁为标准品，具有简便、稳定、结果可靠的优点，对进一步开发利用瓶尔小草中黄酮类化合物很有实际价值。
       【参考文献】
         　　［1］ 朱成兰.云南常用中草药彩色图谱［M］.海口：海南出版社，2003：203.
       
       ［2］ 范亚文，包文美，王全喜.中国瓶尔小草科植物孢子形态的研究［J］.西北植物学报，1997，17（6）：182.
       
       ［3］ 李文芳，黄美娥，唐纯翼，等.甘薯地上部分黄酮类化合物含量变化［J］.天然产物研究与开发，2006，18（2）：304.
       
       ［4］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：附录VIB.
       
       ［5］ 张志信，张仕秀，宋关斌.微波-碱水法提取三七茎叶总黄酮的工艺研究［J］.药物生物技术，2005，12（6）：389.
       
       ［6］ 王 玮，王有为.不同季节水杉叶总黄酮含量变化的研究［J］.武汉植物学研究，2003，21（5）：449.