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       【摘要】 
       目的研究姜黄素是否增强人白血病细胞株HL60对阿霉素的敏感性及其作用机制。方法采用MTT法测定药物的体外杀伤作用，应用流式细胞术分析细胞凋亡。应用RTPCR和Western blot 检测Survivin和XIAP基因的表达。结果姜黄素（2.00～16.00 μmol·L-1）和阿霉素（0.08～0.64 μmol·L-1）同时给药对HL-60细胞可产生增强的协同杀伤效果，同时，细胞凋亡增加，Survivin和XIAP的表达下降。结论联合应用阿霉素和姜黄素可以增强人白血病细胞株HL60对阿霉素的敏感性，下调生存蛋白（Survivin）和X-相关凋亡抑制蛋白（XIAP）表达促进细胞凋亡是其主要作用机制。
       【关键词】  姜黄素； 阿霉素； 协同作用； 生存蛋白； X-相关凋亡抑制蛋白
       Effect of Curcumin on the Sensitivity of Human Leukemia Cell Line HL-60 to Adriamycin
       WANG Lei,  KE Hong,WANG Yiyu, REN Dongming
       （Key Lab of Immunology, Medical College, China Three Gorges University, Yichang 443002, China； Department of Oncology, Gezhouba Central Hospital,  Yichang 443002, China）
       Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of curcumin on the sensitivity of human leukemia cell line HL-60 to adriamycin. MethodsCytotoxicity was determined by the colorimetric MTT viability/proliferation assay. Apoptosis was assessed by flow cytometry. The mRNA levels of survivin and XIAP were measured by RT-PCR. The protein levels of survivin and XIAP were measured by Western blot. ResultsSimultaneous administration of curcumin(2.00～16.00 μmol·L-1) and adriamycin(0.08～0.64 μmol·L-1) resulted in synergistic cytotoxicity and apoptosis for HL-60 cells. Meanwhile, cell apoptosis was increased and the mRNA and protein levels of Survivin and XIAP were significantly down-regulated.  ConclusionCurcumin can sensitize human leukemia cell line HL-60 to adriamycin-mediated apoptosis. Down-regulation of Survivin and XIAP gene expression and promoting cell apoptosis are main mechanisms.
       Key words：Curcumin;   Adriamycin;   Synergistic effect;   Survivin;   XIAP
       
       阿霉素(Adriamycin, ADR)是目前治疗白血病的一线药物，对白血病有着较好的疗效，但是心脏和造血系统毒性限制了它的使用。姜黄素（curcumin, Cur）是姜科植物姜黄的主要有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂、抗动脉粥样硬化及抗癌作用［1］，且长期应用无明显毒副反应。基于以上两药特点，本实验在体外联合使用阿霉素与姜黄素，观察其对人白血病细胞株HL-60的生长抑制作用，并探讨其与抗凋亡蛋白生存蛋白（survivin）和X-相关凋亡抑制蛋白（XIAP）的关系，阐明姜黄素增强人白血病细胞株HL-60对阿霉素敏感性的可能机制，为临床联合使用阿霉素与姜黄素提供理论基础。
       1  材料和方法
       1.1  药物和试剂  人白血病细胞株HL-60为本室保种，常规培养。姜黄素、阿霉素和MTT为Sigma公司产品，RPMI 1640培养基和小牛血清为Gibco公司产品，其余试剂均为分析纯。鼠抗人X－连锁凋亡抑制蛋白(X-linked IAP, XIAP) 单克隆抗体和鼠抗人存活素(Survivin)单克隆抗体均购自Santa Cruz 公司。
       1.2  同时联合用药对HL-60细胞的杀伤作用HL-60细胞悬液2×104/well，接种于96孔板，药物组每孔加不同浓度药液，阴性对照组加等剂量溶剂，每个浓度重复4孔，无细胞孔为背景，置5％CO2，37℃培养48 h后每孔加0.5 mg/ml MTT 20 μl，37℃培养4 h后终止培养，小心吸弃上清液，每孔加150 μl DMSO，振荡10 min使结晶物充分溶解。用酶标仪测OD570。细胞抑制率（%）=(1-药物组ＯＤ/对照组ＯＤ)×100%。
       1.3  应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Survivin和XIAP mRNA的表达 收集各组细胞各5×106，提取细胞总RNA，然后进行逆转录反应。逆转录反应体系：模板RNA 2 μg，10 mmol/ L dNTP 1 μl ，RNA 酶抑制剂(RNasin) 20 U，Oligo dT 1 μl，AMV 逆转录酶200 U，5 ×逆转录酶缓冲液5 μl，终体积为25 μl。反应条件为42℃ 60 min，95℃ 5 min终止反应。PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。Survivin扩增的正义引物为5"-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3"，反义引物为5"-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3"，扩增产物447bp。XIAP扩增的正义引物为5"-GCAGGGTTTCTTTATACTGG-3"，反义引物为5"-TGTCCCTTCTGTTCTAACAG-3"，扩增产物860bp。β-actin基因的正义引物为5"-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3", 反义引物为5"- CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3"，扩增产物295 bp。PCR反应体系：Survivin或XIAP正义引物和反义引物(10 mmol/L)各1 μl，β-actin 正义引物和反义引物(10 mmol/L)各1 μl，三蒸水15 μl，cDNA模板2 μl及Taq DNA聚合酶0.5 μl。PCR反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，62℃退火60 s，72℃延伸60 s，30个循环后于72℃再延伸10 min。取PCR产物5 μl进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果在紫外灯下观察并照相。用PCR产物分析仪扫描电泳带，以与β-actin cDNA的灰度比值作为mRNA的相对表达水平。
       1.4  流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞悬液5×105个/ml，离心，PBS洗1次，加RNA酶和PI（终浓度均为50 mg/L），37℃孵育30 min后上机检测。含有“亚二倍体”DNA的细胞被认为是凋亡细胞，并测凋亡细胞百分率。其结果以ModFit LT for Mac v 3.0软件分析。
       1.5  Western blot检测Survivin及XIAP的表达上述各组细胞用蛋白裂解液提取总蛋白。BCA法蛋白定量。取80 μg蛋白质样品电泳，并电转移至PVDF膜上。封闭膜上非特异结合位点后，加人Survivin(稀释度1∶400)或XIAP(稀释度1∶300)，β-actin (稀释度1∶400)一抗过夜。再加入1∶500的HRP标记的二抗，用ECL常规显影。图像分析系统分析，以与β-actin的灰度比值表示Survivin和XIAP表达的相对强度。 
       1.6  统计分析 实验结果以±s表示，采用t检验。
       2  结果
       2.1  姜黄素与阿霉素同时联合用药对细胞的杀伤作用二药同时合用对HL-60细胞的杀伤呈单纯相加至增强作用(见表1)。从表1中可以看出随阿霉素浓度增高，二药的协同作用下降。如表1中阿霉素为0.08和0.16 μmol/L时，不加姜黄素其抑制率为24.6%和44.8%，加姜黄素16.00 μmol/L，其抑制率均提高到96%以上。
       表1  姜黄素与阿霉素对细胞的杀伤作用（略）
       2.2  联合应用姜黄素对HL-60细胞株凋亡率的影响结果见图1。各实验组均出现明显的亚二倍体凋亡峰，姜黄素组（16 μmol/L）凋亡率为22%±0.45%,  阿霉素组（0.16 μmol/L）凋亡率为56%±0.63%，姜黄素+阿霉素组的凋亡率为81%±0.55%，说明姜黄素与阿霉素对HL-60细胞的凋亡有协同作用（P均小于0.05）。
       2.3  姜黄素阿霉素联合应用对Survivin，XIAP mRNA表达的影响RT-PCR显示各组细胞Survivin，XIAP mRNA均有不同程度的下降，姜黄素和阿霉素有明显的协同作用。结果见表2及图2。
       2.4  姜黄素阿霉素联合应用对Survivin，XIAP 蛋白表达的影响如图3所示，对照组经Western-blot 检测可见明显的Survivin，XIAP 蛋白条带，阿霉素组和姜黄素组 Survivin，XIAP 蛋白水平均较对照组不同程度地下调，阿霉素加姜黄素组仅见微弱条带（P均<0.05） 。
       3  讨论
       
       当前的肿瘤治疗都是以杀死肿瘤细胞为目的，如放疗、化疗、免疫治疗。这些手段治疗肿瘤的机制都离不开启动肿瘤细胞凋亡途径［1］。阿霉素是治疗白血病的常规化疗药，对白血病有着良好的疗效，也是通过启动细胞凋亡来实现其杀瘤作用。但是临床应用易产生耐药及其心脏毒性和造血系统毒性限制了它的使用。姜黄素( Curcumin) 是姜科植物的根茎姜黄的主要成分，除了传统的行气、散风活血的作用外，近年来其抗肿瘤作用越来越受到关注。
       图1  联合应用姜黄素对HL-60细胞凋亡率的影响（略）
       图2  药物作用后HL-60细胞mRNA的表达（略）
       表2  联合应用姜黄素对Survivin，XIAP mRNA的影响（略）
       图3  药物作用后HL-60细胞蛋白的表达（略）
       
       本课题研究了姜黄素和阿霉素对肿瘤细胞的杀伤作用，发现单独应用姜黄素只能对肿瘤细胞产生较弱的杀伤作用。但是姜黄素与阿霉素同时合用对HL-60/ADR细胞可产生单纯相加致增强的协同杀伤效果，尤其是姜黄素与低浓度阿霉素的协同作用更为显著。在临床应用时，如二药同时合用，尤其是姜黄素与低浓度阿霉素同时合用效果可能最佳，既产生显著的协同杀伤效果，又能减少阿霉素的用量，避免其毒副作用。
       
       IAP 家族是近年发现的一类新的细胞内凋亡抑制蛋白，有着广泛的抗凋亡作用。其过度表达引起凋亡不足，与肿瘤发生密切相关。该家族通过N-端杆状病毒的IAP 重复序列区( baculovirus IAP repeats,BIR)可以结合并抑制Caspase， 也通过RING结构域催化Caspase泛素化降解，从而阻止多种因素诱导的细胞凋亡。Survivin和XIAP是该家族中研究最多的成员，Survivin是目前克隆出的最小的IAP，只在肿瘤组织及胚胎中表达［2］，而XIAP是该家族中最强的Caspase抑制蛋白， 在人类白血病、肝癌、肺癌、子宫颈癌等多种恶性肿瘤中都有高表达［3，4］。因此，IAP家族的成员是促进肿瘤细胞凋亡，增加肿瘤细胞化疗敏感性的一个新靶点。本研究发现，阿霉素姜黄素联合应用后，Survivin 和XIAP的表达从mRNA水平到蛋白水平都有显著的降低，减弱了二者对凋亡的抑制作用，促进HL-60细胞凋亡，减少了阿霉素的用量，为其临床联合应用提供了实验依据。
       【参考文献】
         　　［1］ Schmitt CA. Senescence, apoptosis and therapy-cutting the lifelines of cancer［J］.Nat Rev Cancer, 2003, 3(4):286.
       
       ［2］ Costello RT, Rey J, Fauriat C, et al. New approaches in the immunotherapy of haematological malignancies［J］.Eur J Haematol, 2003, 70(5):333.
       
       ［3］ Tamm I, Wang Y, Sausville E, et al. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs［J］.Cancer Res, 1998, 58(23)：5315.
       
       ［4］ Nachmias B, Ashhab Y, Ben-Yehuda D. The inhibitor of apoptosis protein family (IAPs): an emerging therapeutic target in cancer［J］.Semin Cancer Biol, 2004, 14(4):231.