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       【摘要】 
       目的探讨丹参饮片中采用渗漉法提取脂溶性部位的最佳工艺条件。方法以丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量为指标，采用L9(34)正交实验进行提取工艺全面优选，并用反相高效液相色谱（RP-HPLC）法测定其含量。结果最佳乙醇渗漉工艺为：药材粉碎至绿豆粒大，用15倍量95%乙醇冷浸24 h后，渗漉速度3 ml/min。结论采用渗漉法提取丹参中脂溶性部位，操作简便，方法可行，降低了生产成本，提高了药材利用率，使实验结果具有实际应用价值。
       【关键词】  丹参； 正交实验； 丹参酮ⅡA； 隐丹参酮
       Study on Extraction Method of Liposolubility Active Principles of Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae
       WEI Min, ZHANG Jinghua
       (Jiangsu Institute of Botany, Nanjing 210014,China；Guangzhou Regenex Company, Guangzhou 510530，China)
       Abstract：ObjectiveTo study the best extraction method of the liposolubility active principles of Rhizoma Salviae Miltiorrhizae.MethodsThe extraction process was studied by orthogonal design with the contents of Tanshinone ⅡA and cryptotanshinone determined by RP-HPLC as index．ResultsThe best extraction condition of liposolubility part was A3B1C2D2. That is to say, adding fifteen-times 95% alcohol, after 24 hours cold-soaking, percolateing with 3 ml/min.ConclusionThe extraction method for Rhizoma Salviae Miltiorrhizae can save time and energy and be suitable for the modern production．
       Key words：Salvia miltiorrhiza;  Orthogonal design;   Tanshinone ⅡA;   Cryptotanshinone
       
       丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。味苦，微寒，归心、肝经，具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦之功效，用于月经不调、经闭痛经、癥瘕积聚、胸腹刺痛、疮疡肿痛、心烦不眠、肝脾肿大、心绞痛等病症。
       
       丹参水溶性成分主要有丹参素以及丹参酚酸类，对这一部分的研究较多。丹参的脂溶性成分主要为丹参酮类化合物，主要成分有丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、二氢丹参酮等，具有天然抗氧化活性、天然心血管药理作用以及抗菌消炎作用，还具有明显的抗肿瘤作用。
       1  器材
       
       Aglient1100系列液相色谱仪（美国惠普公司）；丹参酮、隐丹参酮对照品（中国药品生物制品检定所）；丹参饮片（南京本草药店），经自我鉴定为丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的根。
       2  方法与结果
       2.1  丹参提取脂溶性成分指标的建立
       2.1.1  干膏率测定参照2005年版《中国药典》附录XA浸出物测定法，精密量取相当于丹参5 g的药液，置于已干燥恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，移于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算干膏收率，干膏收率（%）=干膏重量/丹参重量×100%。
       2.1.2  丹参酮ⅡA、隐丹参酮的含量测定预试发现，由于丹参中丹酚酸类成分在波长268 nm处有着较强的紫外吸收，在进行提取工艺考察时，许多工艺在脂溶性成分被提出时，水溶性成分同时被提出，从而使UV法测定总丹参酮含量的方法在提取工艺考察过程中很不精确，故通过使用HPLC测定丹参酮ⅡA以及隐丹参酮的含量，对丹参脂溶性部位的提取工艺进行评价。
       
       色谱条件：色谱柱为Scienhome KromasilC18(150 mm×4.6 mm)及预柱， 流动相为甲醇-水(75∶25 )，检测波长270 nm，柱温30℃，流速0.8 ml /min，理论板数以丹参酮ⅡA，隐丹参酮计均不低于2 000。图谱见图1～2。
       图1  隐丹参酮、丹参酮ⅡA的色谱图（略）               
       图2  样品色谱图（略）     
       
       丹参酮ⅡA储备液的制备：精密称取用五氧化二磷干燥5h的丹参酮ⅡA对照品4.82 mg置50 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
       
       隐丹参酮储备液的制备：精密称取用五氧化二磷干燥5 h的隐丹参酮对照品4.83 mg置25 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。
       
       混合标准品溶液的配制：精密量取2 ml丹参酮ⅡA储备液和1 ml隐丹参酮储备液置5 ml棕色容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，最终浓度为丹参酮ⅡA 38.56 μg/ml，隐丹参酮38.64 μg/ml。
       
       标准曲线绘制：精密吸取上述混合标准品溶液2, 6, 10, 15，20 μl依次进样，在上述色谱条件下测定，记录色谱图、峰面积值，并以峰面积Y对进样量X(μg)回归，结果可见：丹参酮ⅡA标准曲线Y=7 083.3X-17.59(R=0.999 9)，线性范围为0.077 12 ～0.771 2 μg。
       
       隐丹参酮标准曲线Y=6 356.5X-11.28 (R=1)，线性范围为0.077 28～0.772 8 μg。
       
       精密度实验：取混合标准品溶液，分别进样10 μl 5次，测得峰面积值，丹参酮ⅡA的平均峰面积为2 723.0，RSD=0.13%；隐丹参酮的平均峰面积为2 431.1，RSD=0.15%，表明使用该仪器精密度良好。
       
       稳定性实验：对同一样品溶液分别在放置0,1，2，3，6，9，12 h后进样，测得峰面积值，结果表明，丹参酮ⅡARSD=0.73%, 隐丹参酮RSD=0.62%，表明样品在12 h内稳定。
       
       样品的测定：将丹参提取液过滤，滤液合并后，加入乙醇定容至500 ml。从中精密量取2 ml用甲醇定容至10 ml容量瓶中，微孔滤膜过滤，进样10 μl，按外标法计算其中丹参酮ⅡA以及隐丹参酮含量。
       2.2  脂溶性部位提取工艺研究渗漉是常用的浸出方法之一，渗漉时，溶剂渗入药材的细胞中溶解大量的可溶性物质之后，浓度增加，密度增大而向下移动，上层的浸取溶剂或稀浸液置换位置，造成良好的浓度差，使扩散较好地自然进行，故其浸出效果优于浸渍法，提取也较完全，而且省去了分离浸出液的时间和操作，故采用渗漉法来研究丹参中脂溶性部位的提取。
       
       在渗漉法提取脂溶性部位工艺研究过程中，拟对乙醇浓度、粉碎度、渗漉总的乙醇倍量以及渗漉流速的不同水平进行研究，以便寻找出最佳渗漉提取法。具体因素水平的设计详见表1。精确称量每份20 g，先用适量乙醇润湿后，待药材充分膨胀后装入自制渗漉筒中，装完后先向筒内加入适量各浓度的乙醇溶液至高出药粉表面1 cm，加盖冷浸24 h后再按L9(34)设定具体工作安排表进行实验，测定并计算出干膏收率、丹参酮ⅡA得量（mg/g）、隐丹参酮得量（mg/g）、丹参酮ⅡA和隐丹参酮总量（mg/g），实验结果用极差法及方差法进行分析详见表2～4。
       表1  丹参渗漉提取正交设计因素水平表（略）
       表2  丹参渗漉正交安排表（略）
       表3  丹参酮ⅡA的得量方差分析表（略）
       表4  隐丹参酮的得量方差分析表（略）
       根据对方差和极差的综合分析可以发现，乙醇浓度是丹参渗漉工艺的最主要影响因素，故95%为最佳渗漉浓度，收集渗漉液量作为次要影响因素，虽然通过直观分析，以20倍量为最佳，但是由于15倍量的渗漉结果与20倍量相差很小，从节约溶剂方面考虑，采取收集15倍量渗漉液；实验中发现细粉在渗漉过程中，容易造成孔隙堵塞，故选用粗粉为佳，而绿豆粒大小虽然效果相对差一些，但并无显著差异，且有利于后续水提工艺的进行，故药材粉碎度采用绿豆粒大；渗漉速度对工艺的影响最小，且3 ml·kg-1·min-1与1 ml·kg-1·min-1对有效成分的提取量相差较小，而5 ml·kg-1·ml-1提取量相对较小，从节约时间和提高提取率方面考虑，采用3 ml·kg-1·min-1为佳。综上所述，我们筛选的最佳乙醇渗漉工艺为A3B1C2D2，即药材粉碎至绿豆粒大，用适量乙醇润湿后，待药材充分膨胀后装入渗漉筒中，装完后先向筒内加入适量各浓度的乙醇溶液至高出药粉表面1 cm，加盖冷浸24 h后每1 000 g药材以95%乙醇的按3 ml/min的速度渗漉，收集15倍量乙醇体积的渗漉液即得。由于A因素已经是95%乙醇，大生产上无法使用更高浓度的乙醇，故关于此因素的追加实验舍去。
       
       采用以上确定的最佳条件进行了验证实验，即以20 g丹参药材，按条件收集750 ml体积的渗漉液，测定得丹参酮IIA的得率为2.77 mg/g生药，隐丹参酮的得率为1.81 mg/g生药，总量为4.58 mg/g生药，实验结果与正交实验中的最佳工艺相比相差较小，故从时间、能源各方面综合考虑，认为此工艺为最佳工艺。
       3  讨论
       
       丹参药材由于原植物的属种不同，产地不同，其所含总丹参酮的量有较大差异。据有关文献报道，丹参药材中总丹参酮的含量在0.03% ～1.49%不等。目前对总丹参酮的含量要求尚无具体规定。2005版《中国药典》规定［1］丹参以丹参酮ⅡA为指标，含量不得少于0.2%。本研究考虑到丹参酮ⅡA和隐丹参酮在总酮中所占比例均比较大，所以本实验以丹参酮ⅡA和隐丹参酮作为对照品绘制标准曲线，由此计算脂溶性部位的含量。
       
       直观分析和方差分析结果表明各因素对脂溶性部位收率的影响大小依次为乙醇浓度>渗漉液收集量>粉碎度>渗漉流速。其中乙醇浓度对丹参酮和隐丹参酮收率有显著影响，其他因素为误差项。根据缩短生产周期，降低生产成本的原则，由此得出丹参渗滤法提取的最佳工艺为药材粉碎至绿豆粒大，用15倍量95%乙醇冷浸24 h后，渗漉速度3 ml/min。
       
       验证实验结果：总丹参酮的收率与正交实验9号(条件为浸泡24 h、95%乙醇、乙醇量为15倍、渗滤速度为3 ml/min)的结果相接近，表明该最佳提取工艺具有良好的重复性。
       【参考文献】
         　　［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社，2005：52.